木瓜蛋白酶的固定化技术
木瓜蛋白酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物 工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链 内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋 白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能， 能把蛋白水解物合成为类蛋白质。木瓜蛋白酶在医药 食品 日化品等 行业方面有着广泛的应用。
第二篇文章固定化酶的最适PH值为5.7， 与游离酶相比向酸性方向移动；
第三篇文章固定化酶的最适PH值为8.0， 与游离酶相比向碱性方向移动。
后两篇文章固定化酶的最适温度较游离 酶相比均提高一个点，大约80℃左右。
酶的操作稳定性
第一篇
第二篇
第三篇
使用7-8次后酶 重复使用13次后 使用6次后酶活
活是原固定酶的 酶活逐渐降低 仍保持在75%左
实验材料及仪器：壳聚糖 可溶性淀粉 戊二 醛 红外光谱仪 紫外分光光度计 酸度计 恒温震 荡仪
试剂：Tris-Hcl缓冲液 酶液（以缓冲液配制）
固定化酶的制备流程：
以可溶性淀粉为原料制备双醛淀粉
固定化载体的制备（壳聚糖小球 Chitosan-DAS柔性载体 Chitosan-GA手臂载体）
固定化酶的制备（以柔性载体固定 以手臂 载体固定）
Ⅱ.微孔淀粉-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的 研究 金峰 Ⅲ.金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的 研究 刘琳琳、曾力希等
一、壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶
采用酶柔性固定化模型（在固定化载体上连上 有足够长度且亲水的分子链，最后将酶结合到柔 性链上），以壳聚糖为载体，双醛淀粉为柔性链， 对木瓜蛋白酶进行柔性固定化。
由图可知载酶量受到固定化时间和固定化反应介 质PH的影响，最优化条件是固定化4h，反应介质 的PH值为7
温度、PH对酶活力的影响
由试验结果知：酶的固定化技术使木瓜蛋白酶对 PH的耐受力提高一个点，使酶对温度的耐受力提 高10℃
三种固定化技术的比较：
相同点：①三种研究均采用了固定化技术达 到了共同的目的：提高了木瓜蛋白酶的稳 定性，是木瓜蛋白酶可以重复利用，降低 了生产成本。 ②三种研究酶活的测定方法相同， 均采用紫外分光光度法：加入激活剂和磷 酸缓冲液以及酪蛋白，37℃反应10min加入 三氯乙酸终止酶反应，测定其消光值。
三、金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶 的研究
以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体，利用金属螯 合配体（IDA-Cu+)与蛋白质表面供电子氨基酸相 互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶
实验材料与仪器：木瓜蛋白酶 盐酸半胱氨酸 亚 氨基二乙酸 EDTA 四氧化三铁磁流体 琼脂糖 UV751GD型紫外可见光分光光度计 GFU-202C 原子吸收分光光度计 85-2型恒温磁力搅拌器 AB204-E型电子分析天平 PB-10型酸度计
一半
右
酶活力的测定
固定化条件的优化：
由试验结果分析知：固 定化酶技术使木瓜蛋 白酶的活性明显提高。
由上图可知：固定化木瓜蛋白酶的最优化条件是： 固定化温度为24℃，固定化PH是8.0
二、微孔淀粉-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶 的研究
采用微孔淀粉-海藻酸钠包埋法固定化木瓜蛋白 酶（海藻酸钠与Ca+形成“蛋盒”模式，包埋木 瓜蛋白酶）
固定化酶流程：
载体的制备（磁性琼脂糖微球采用反相悬浮 包埋法制备,然后加入IDA，最后加入氯化铜 制的琼脂糖-IDA-铜离子螯合载体） 酶 的固定化（螯合载体+木瓜蛋白酶室温下震 荡4h，用磷酸缓冲液洗涤数次） 测定 酶活力 载体的再生（再生载体可对酶再 次固定化）
结果与分析：
随着载体吸附铜离子的量的增加，载酶量 逐渐增加，固定化酶活在1.5左右出现最高 峰后逐渐下降。
③三种固定化技术均造成酶对底物的亲 和力降低：第一篇由于柔性链的作用降低 了酶的亲和力；第二篇由于包埋技术，底 物要走很长的路径才能与底物结合导致亲 和力下降；第三篇由于金属螯合载体的电 荷作用导致亲和力下降。
不同点：
固定化的原理
第一篇
第二篇
第三篇
酶柔性固定化模型 包埋法
金属螯合载体
第一篇文章在研究阶段主要关注的是 Chitosan-DAS和Chitosan-GA的固定化条 件的不同，所以下面来比较后两篇文章的 不同。
实验材料与设备：木瓜蛋白酶 微孔淀粉 海藻酸钠 WL500CY高剪切乳化机 PHS-3B型PH计 T-6紫外可见光分光光度计
固定化酶的制备流程：
①将木瓜蛋白酶溶解于去离子水中，加一定 量的微孔淀粉混合均匀，充分吸附后高速 均质，待用
②海藻酸钠+50ml水，加热 溶解+10ml木 瓜蛋白酶微孔淀粉混合液，搅拌均匀 用 5号注射器加在一定质量分数的氯化钙溶液 中，拉成管状 凝固3min 用蒸馏水洗 涤数次，置于冰箱冷藏备用
固定化技术的优点：一、可以做成各种形状，如颗粒状、管状、 膜状，装在反应槽中，便于取出，便于连续、反复使用。二、稳定性 提高，不易失去活性，使用寿命延长。三、便于自动化操作，实现用 电脑控制的连续生产。
采用固定化技术降低了生产成本，下面是对木瓜蛋白酶固定化的 研究。
查阅文章:
Ⅰ.壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶 魏荣卿、沈斌等
③测定游离酶和固定酶的酶活力
结果与分析：
由以上三个图知：优化条件 为最适微孔淀粉浓度为4%， 最适海藻酸钠浓度为3%， 最适氯化钙浓度为5.5%
条件 PH
游离酶 6.5
固定化酶 5.7
温度
55℃
72℃
稳定性
机械强度增加， 易受其他因素
稳定性提高
的影响
酶反应动力学 3.19mmol/L