2、样品制备
植物代谢物样品制备分为组织取样→匀浆→抽提→ 保存→样品预处理等步骤。 代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇和己烷等)分 别提取,获得水提取物和有机溶剂提取物,从而把非极性 的亲脂相和极性相分开。 分析之前,通常先用固相微萃取、固相萃取和亲和 色谱等方法进行预处理。 然而植物代谢物千差万别,其中很多物质稍受干扰 结构就会发生改变,且对其分析鉴定所采用的设备也不 同。目前还没有适合所有代谢物的抽提方法,通常只能 根据所要分析的代谢物特性及使用的鉴定手段选择合适 的提取方法。而抽提时间、温度、溶剂成分和质量及实 验者的技巧等诸多因素也将影响样品制备的水平。
（2）毛细管电泳－质谱联用技术(CE/MS) CE/MS分离样品效率比普通的色谱质 谱联用要高得多,更为便利的是其耗时很 短,往往在10分钟内就能完成一个样品的 分析过程。 Tolstikov等(2003)用CE/MS对拟南芥 进行代谢组分析,分离效果远远超过了 Fiehn等用GC/MS进行的先期工作,检测到 超过700个不同的色谱峰值,其中包括许多 以前未检测到的脂类化合物及次生代谢物。
LC/MS中目前应用较广的是高效液相色谱和 质谱联用(HPLC/MS)。HPLC与GC原理相似,但在进 样前不需进行衍生化处理,适合那些不稳定、不 易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。 HPLC/MS选择性和灵敏度都较好,但分析的时间相 对较长,且需依赖纯的参照物。 Fiehn(2003)利用HPLC/MS检测笋瓜 (Cucurbitamaxima Gelber Zentner)叶柄和叶 片抽提物,检测到了超过400种代谢物,有90种被 定性,其中大部分是氨基酸、糖和糖苷。 Huhman和Sumner(2002)在紫花苜蓿和蒺藜状 苜蓿中各鉴定出15个和27个皂角甙,并在紫花苜 蓿中找到了2个新的乙二酸皂角甙。
（1）非监督（学习）方法
非监督方法是用来探索完全未知的数据特征 的方法,对原始数据信息依据样本特性进行归类, 把具有相似特征的目标数据归在同源的类里,并 采用相应的可视化技术直观地表达出来。 应用在此领域的常见方法有: ●聚类分析(cluster analysis) ●主成分分析(principal components analysis,PCA)
2、意义
●通过研究不同物种的代谢产物 ,可以指导植物分 类学 ,对植物进行更加合理的分类; ●通过研究不同基因型植物的代谢物 ,可以发现新 的功能基因 ,促进转基因植物的研究 ,同时还可以对 转基因植物及其在食用方面的安全性进行代谢物组学 水平上的评估; ●通过研究不同生态环境下植物的代谢产物 ,了解 植物的区域性分布。如果所研究的植物是某种药用植 物 ,则就可以应用于中药道地药材的确定; ● 植物在受到某种内部或外界因素刺激之后会产生 的特定的应激变化 ,最终会表现在代谢物的改变上 , 通过研究这种变化规律 ,为从植物中定向培养得到某 一特定代谢物提供指导。
数据分析与解释
代谢组学研究技术步骤
1、植物培养（栽培）
对研究对象进行培育的目的是为了对样本的 稳定性进行控制 ,相对于微生物和动物而言 ,植 物的人工栽培需要考虑更多的问题,如中药材在 不同年龄、不同发育阶段、不同部位以及光照、 水肥、耕作等环境因素的微小差异都可引起生理 状态的变化,而这些非可控及可控双重因素的影 响很难进行精确的控制,从而影响药用植物代谢 组研究的重复性。为了解决以上问题 ,推荐使用 大容量的培养箱 ,定时更换培养箱中栽培对象的 位臵,以及使用无土栽培技术等, 利用无土栽培 系统将水和养分直接引入植物根部,并且对供给 量进行精确地控制 ,大大提高了实验的重复性。
代谢组： 是指细胞或者生物体内的所有代谢物的 总和，也有人将它定义为细胞、组织、器 官或者生物体内的所有小分子代谢组分的 集合。 代谢组学： 通过大量代谢成分的定性、定量分析来 定义生物体的生化表型(代谢表型)及其与 基因型的关系，从而为研究基因功能、诠 释生命现象提供大量的代谢信息，这就是 代谢组学（metabolomics)。
因此，以DNA、mRNA、蛋白质和代谢物为研究对象的基因组 学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学是一个密切相关的整体， 他们共同构成系统生物学（systems biology)。
基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的关系
系统生物学研究的四个层次
三、植物代谢组学的研究方法
植物材料培养
样品制备
成分分析与鉴定
For example: Roessner等(2000,2001)利用GC/MS对马 铃薯进行高通量代谢物分析,同时检测到150 种化合物,其中77种被鉴定为氨基酸、有机酸 或糖。 利用GC/MS进行代谢组学研究的代表性 工作是Fiehn等(2000)的一系列有关植物代 谢的研究。他们用GC/MS对模式植物拟南芥 的叶子提取物进行了研究,定量分析了326个 化合物,并确定了其中部分化合物的结构。
Examples:
Ward等(2003)用1H-NMR对多种不同生态型的拟南芥 进行了代谢组分析,在碳水化合物和脂肪族物质中都发 现了差异,说明了植物代谢物和生态型差异的相关性。 Hyung-Kyoon等(2004)用1H-NMR对野生型和过表达 水杨酸合成基因的转基因烟草(Nicotiana tabacum)的 叶片和叶脉进行了研究,通过进行TMV嫁接和对照实验, 得到多个峰值变化,大部分峰被鉴定为氯原酸、苹果酸 和糖。此实验提供了一种有效的不需过多步预处理程序 的区分野生型和转基因植物的方法。 NMR也有其缺点: ①与GC/MS和LC/MS相比,NMR的缺点是灵敏度低,有 可能形成信号重叠,且其对样品制备的要求很高。 ②因为动态范围有限,很难同时测定生物体系中共 存的浓度相差较大的代谢产物。
4、数据分析与解释
样品成分分析鉴定之后,需要对所获得的数据 进行相应的整合处理,这也是代谢组学研究中十分 关键的步骤。应用高通量的检测分析工具可以得 到海量的数据,如果不对其进行合理的处理,这些 纷扰的数据反而对研究工作是有害无利的。可应 用模式识别和多维统计分析等方法从这些大量的 数据中获得有用的信息,这些方法能够为数据降维, 使它们更易于可视化和分类。 目前数据分析常用的方法有两类： ●非监督方法(unsupervised method) ●有监督方法(supervised method)
近年来,随着生命科学研究的发展,尤其是完成 拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻（Oryza sativa)等植物的基因组测序后,植物科学发生了翻 天覆地的变化。有人说生命科学研究跨入了后基因 组时代。 人们已经把目光从基因的测序转移到了基因的 功能研究。在研究DNA的基因组学、mRNA的转 录组学和蛋白质的蛋白组学后,接踵而来的是研究 代谢物的代谢组学。
植物代谢组学及其应用
河南农业大学生命科学学院 赵会杰
目 录
一、植物代谢组学的概念和意义 二、代谢组学在系统生物学中的地位
三、植物代谢组学的研究方法
四、代谢组学在植物科学中的应用 五、展望
一、植物代谢组学的概念和意义
1、概念
生物学中“组”的概念： ◆“组”：来源于希腊语ome，意指每个、所有、 全部。 ◆以它为后缀最先用于基因组：genome,指一个 物种的全部遗传组成。 ◆自基因组学概念提出后，带组学（omics)的概 念出现有200多种。如蛋白组学、代谢组学等。
(1/MS)
色谱是最常用和有效的分离分析工具,其与质谱 的联用则可以完成从成分分离到鉴定的一整套工作。 GC/MS和LC/MS可以同时检测出数百种化合物,包括糖 类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代 谢物。
GC/MS有很好的分离效率且相对较为经济,但需 要对样品进行衍生化预处理,这一步骤会耗费额外的 时间,甚至引起样品的变化。受此限制,GC/MS无法分 析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产 物。
二、代谢组学在系统生物学中的地位
20世纪末到本世纪初，大规模的基因组测序 工作产生了海量数据。但仅仅是依赖DNA序列我 们能够得到的信息还是有限的，科学家迫切希望 在整体水平上了解基因表达的特征和基因所编码 的产物的功能。因此， “功能基因组学 (functional genomics)”的研究逐渐兴起。它是 通过大规模地分析细胞内转录水平(转录组)和蛋 白质水平(蛋白质组)上的变化，进而推测基因功 能，这就开启了“功能基因组学”的研究。
（3）核磁共振
在代谢组学领域,核磁共振最初被用于病理生理学和 药理毒理学方面，但目前也已被广泛用于植物代谢组学 研究。其优点是： A.不同于质谱具有离子化程度和基质干扰等问 题,NMR没有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。 B.NMR无损伤性,不破坏样品的结构和性质,可在接近 生理条件下进行实验,可在一定的温度和缓冲液范围内选 择实验条件,可以进行实时和动态的检测。 C.NMR氢谱的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一 对应的,所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关 的谱峰,图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对 含量,更为直观。 因此,NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。
Examples：
Aharoni等(2002)利用高分辨率的FTIR/MS联 用仪器对凤梨草莓(Fragaria ananassa)组织进 行了分析,依据不同的质荷比找到了5 844个不同 质量的物质,并根据对化合物中高含量的元素的 精确质量测定估计了其中一半以上物质的化学结 构式。 结果表明,在草莓的不同组织中都含有多种 类的初生代谢物(如氨基酸、脂肪酸和碳水化合 物)及次生代谢物(如类黄酮和萜类化合物)。
（4）傅里叶变换红外光谱-质谱联用FTIR/MS
FTIR主要测定样品中各成分的功能基团和高极性 键的振动,而特定的化学结构有特定的吸收频率,通过 测定实验样品的红外吸收频率和强度,可以辨别出各 个成分。 FTIR优点： 扫描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比及 测定光谱范围宽。 FTIR缺点： 不可区分异构物,且组分片段和一些络合离子也 对其有影响,由于离子抑制不能进行定量分析。