用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的 蛋白质首先被洗脱下来，增加阴离子浓度， 含电荷多的蛋白质也被洗脱下来。
不断增加离子浓度，收集各种组分，对每种 收集组分进行分析。
详细可查阅：5.1 离子交换层析
海胆胚提取物层析分析结果
问题：为什么用UMP?
Nature 1969; 224:234-237
分离真核细胞的RNA聚合酶
Nature 1969; 224:234-237
材料：海胆胚和大鼠肝细胞核提取物
海胆，徐辉 2011-10-22摄于外伶仃岛
方法：离子交换层析
离 子 交 换 层 析 原 理 示 意 图
注：不同颜色代表电荷不同的蛋白质
阴离子交换树脂分离蛋白质的原理
将阴离子交换树脂（带正电荷）颗粒填充在 层析管内，可吸附带负电荷的蛋白质，由于 各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它 们被吸附的程度也不同。
抑制各种RNA聚合酶的活性，检测 各种RNA基因的转录变化。
巧妙！
α-鹅膏蕈（ xùn ）碱（α—amanitin ） 致死性毒蘑菇鬼笔鹅膏菌（Amanita phalloides） 产生的具有双环结构的八肽毒素
此菌极毒，中毒后潜伏期长。发病初期以胃肠道 病症。恶心、呕吐、腹痛、腹泻、此后一、两天 似乎病愈，实际上毒素进一步损害肝、肾、心脏、 肺、大脑中枢神经系统。病情很快恶化，出现呼 吸困难，烦燥不安，谵语、面肌抽搐、小腿肌肉 痉挛。病情进一步加重，出现肝、肾细胞损害， 黄胆，急性肝炎，肝肿大及肝萎缩，最后昏迷。 死亡率高达50%以上，甚至100%。
Decreased RNA content in mouse liver nuclei after intoxication with α-amanitin. L. Fiume, F. Stirpe Istituto di Patologia generale, Università di Bologna Bologna, Italy
After his retirement from UCSF in 1991, William Rutter began a second distinguished career as spokesman and developer of the biotechnology industry, and subsequent years have brought new work and more recognition.
The Biochemical journal Jun1967
Biological Sciences: Specific Action of α-Amanitin on Mammalian RNA Polymerase Protein Jacob, S. T. , Sajdel, E. M. , and Munro, H. N Department of Nutrition and Food Science, Massachusetts Institute of Technology. Nature Jan 1970
1942University of Washington
2003 Lasker Award
1928University of Washington
2000 Lasker Award (scientists in Chiron corporation)
William Rutter的传奇一生
William Rutter 1969-1991 UCSF Chiron corporation founder
Ph.D., 1969 UCSF
Ph.D., 1969,
post-doc 1969
Harvard University Harvard University
科研之巅峰：一年四篇nature
Question2： 真核生物的三种RNA聚合酶各转录什
么RNA?
Strategies:
纯化三种RNA聚合酶，分析它们体 外可转录哪些特定的基因;
Role of DNA-dependent RNA polymerase 3 in the transcription of the tRNA and 5S RNA genes. William J. Rutter and Robert G. Roeder Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco. PNAS May 1974
Robert Weaver
post-doc 1969-1971 UCSF
Between 1952 and 1968, Rutter held positions at the University of Wisconsin, the Karolinska Institutet, University of Illinois, Stanford University and University of Washington.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Sep 1966
Effect of alpha-amanitin on ribonucleic acid synthesis and on ribonucleic acid polymerase in mouse liver. F. Stirpe, L. Fiume
原核生物一样吗？
Clues: 真核生物核糖体基因具有如下特点：
1. GC含量高（60%），其它基因DNA GC含量 40%；
2. 拷贝极多（几百-两万）； 3. 定位在核仁
Surmise: 真核生物中可能不止一种RNA聚合酶
分离真核细胞的RNA聚合酶
Robert Roeder & William Rutter
In 1981 Rutter and two colleagues founded Chiron.
He conducted Hepatitis B research, which resulted in development with Chiron and Merck of the vaccine for Hepatitis B, the first recombinant vaccine.
地理分布生长在林地，特别是橡树林或山毛榉 树林里，夏秋季在阔叶林中地上也有单生或群 生。 分布在我国江苏 江西 湖北 安徽 福建 湖南 广 东 广西 四川 贵州 云南等地。
致命白毒伞（毒蕈类） 外形与一些传统的食用蘑菇较为相似， 极易引起误食，喜欢在黧蒴树的树荫 下群生。黧蒴树在广州地区白云山、天麓湖、 华南植物园等山地均有分布。在新鲜毒菇中毒 素含量很高，50克左右的白毒伞菌体所含毒素 便足以毒死一个成年人。中毒者死亡率高达90 ％以上，是历年广州地区毒菇致死事件的罪魁 祸首。
什么?
Strategies: 层析分离纯化各种RNA聚合酶，SDSPAGE变性胶电泳，观测各蛋白亚基的 大小。
Isolation of ribonucleic acid polymerases I, II, and III from Saccharomyces cerevisiae.
Hager, G L; Holland, M J; Rutter, W J
大鼠肝提取物层析分析结果
Nature 1969; 224:234-237
大鼠肝提取物核质和核仁馏分层析分析结果
大鼠肝细胞核质馏分
大鼠肝细胞核仁馏分
PNAS 1970; 65:675-682
分离原核细胞的RNA聚合酶
Richard Burgessபைடு நூலகம்& Andrew Travers
Harvard University Now: University of Wisconsin
High yields of each enzyme activity are obtained, allowing the preparation of approximately 10 mg of polymerase I, 25 mg of polymerase II, and 12 mg of polymerase III from 1.2 kg of cells (wet weight).
不同浓度的α-Amanitin对三种RNA聚合酶活性的影响
PNAS 1974; 71(5): 1790–94.
α-Amanitin对小RNA合成的影响
5S= 5SrRNA, 4S=4StRNA.
PNAS 1974; 71(5): 1790–94.
75%-85% 3-5%
15%
microRNA
Question3： 真核生物的三种RNA聚合酶的组成是
3 染色质结构及其对基因转录的影响
4 mRNA的加工：剪接、加帽与加尾
5 其它RNA的加工、转录后基调控
6 蛋白质翻译
- 分子生物学研究方法
寄语
认识分子生物学的重要地位 提纲挈领，把握重点 理解胜于记忆 重视基础研究方法 尊重历史人物 泛读
What is Molecular Biology ?
In 1969, UCSF succeeded in recruiting Rutter to UCSF to develop a new department of Biochemistry and Biophysics.
He completed structural and functional analysis and cloning of the rat and human insulin.
Specific Inhibition of Nuclear RNA Polymerase II by α-Amanitin Thomas J. Lindell, Fanyela Weinberg, Paul W. Morris, Robert G. Roeder and William J. Rutter Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco. Science Oct 1970