Principle of Thermal Lens Microscopy
Laser Objective lens Objective lens Objective lens Objective lens Excitation beam Temperature Glass Change Thermal lensin gradient Heat ray effectlocus formed by Spatial profile released thermal of light diffusion intensity Change in light intensity Sample Detector
Sample Porphyrin Dye DNA(500 bp) Dye Ag nanoparticle Medium Benzene Water Polyacrylamide gel matrix Water LOD 0.6 molecules 48 molecules 7 molecules 480 molecules 1 particle 1 2 3 4 Ref.
拉曼光谱与红外光谱分析方法比较
拉曼光谱 光谱范围40-4000Cm-1 光谱范围 红外光谱 光谱范围400-4000Cm-1 光谱范围
水可作为溶剂 样品可盛于玻璃瓶， 毛细管等容器 样品可盛于玻璃瓶， 中直接测定 固体样品可直接测定
水不能作为溶剂
不能用玻璃容器测定
需要研磨制成 KBr 压片
二、仪器
激发虚态 E1 + hν0 ν E0 + hν0 ν hν0 hν ν ν0 V=1 V=0
Rayleigh散射 散射
h(ν0 - ∆ν ν ∆ν)
Rayleigh散射： 散射： 散射 弹性碰撞；无 弹性碰撞； 能量交换， 能量交换 ， 仅改变 hν ν0 方向； 方向； Raman散射： 散射： 散射 E1 非弹性碰撞； 非弹性碰撞 ； E0 方向改变且有能量 交换； 交换；
三、应用
1．定性：定骨架，红外用于定端基 ．定性：定骨架， 2．分子结构：鉴别顺反异构 ．分子结构： 3．聚合物、生物分子、液晶、络合物、表面、催化的研究 ．聚合物、生物分子、液晶、络合物、表面、
1-1 激光基础知识 1-2 激光拉曼光谱分析法 1-3 激光吸收光谱
一、内腔吸收激光分析法 二、激光光声光谱分析法 三、热透镜显微镜
1)K. Sato, et al., Anal. Sci., 15, 525 (1999) 2)2) J.-J. Zheng, et al., Anal. Chem., 72, 5003 (1999) 3) K. Uchiyama, et al., Jpn, Appl. Phys., 39, 5316 (2000) 3)4) K. Mawatari, et al., Anal. Chem., 70, 5037 (1998)
二、激光的特性
1．单色性好 ． 氦氖激光的谱线宽度： 氦氖激光的谱线宽度：10-8nm 2．相位一致（相干性好） ．相位一致（相干性好）
3．方向性好 ． 发散角～10-4弧度 发散角 4．亮度高 ． 巨脉冲红宝石激光器： 巨脉冲红宝石激光器：1015w/cm2
三、激光器
1．激励能源（泵浦源） ．激振-转能级的光谱 均为反映分子振 转能级的光谱, IR的吸收峰与拉曼散射峰相对应 转能级的光谱 的吸收峰与拉曼散射峰相对应 无对称中心的分子：红外 拉曼 无对称中心的分子：红外+拉曼 有对称中心的分子：红外、 有对称中心的分子：红外、拉曼只有一种 少数分子既无红外也无拉曼
1-4 激光发射光谱
一、内腔吸收激光分析法
将样品置于光学谐振腔内，提高检测灵敏度。
二、激光光声光谱分析法
光声效应：非辐射跃迁产生的热能加热样品周 围的气体，产生压力变化。灵敏度高，但是对环境 要求高。
三、热透镜显微镜
利用激光产生的热透镜效应。
Block Diagram of TLM
Limit of Detection Using TLM
～1µm ～1µm
High sensitivity at the single molecule level
Intracellular Distribution of Cytochrome c Before and After Apoptosis －Non-Labeled Imaging－
Before apoptosis After apoptosis
1-1 激光基础知识
一、激光的产生 二、激光的特性 三、激光器
1-2 激光拉曼光谱分析法 1-3 激光吸收光谱 1-4 激光发射光谱
一、激光的产生
1．自发辐射和受激辐射 ．
原子处于低能态E 原子处于低能态 1 ， 从外界吸收一个能 量为∆ 的光子达到高能态 的光子达到高能态E 称为光吸收 光吸收。 量为∆E的光子达到高能态 2，称为光吸收。
激光单色性好，扩大了线性范围。
三、分子荧光
激光诱导荧光
1．UV-VIS激光 ． 激光
灵敏 生化样品 微区分析 不需激发单色器
2．红外荧光 ．
可产生较强的荧光信号
3. 多光子荧光
虽然诺贝尔奖得主Göppert-Mayer早在 早在1931年就预言了多光子激发 虽然诺贝尔奖得主 早在 年就预言了多光子激发 的可能性，但是直到激光技术出现后，才有了突破性的发展。 的可能性 ， 但是直到激光技术出现后 ， 才有了突破性的发展 。 1961年 年 Kaiser 等在 等在CaF２: Eu 2+晶体中首次观察到了双光子激发现象。 晶体中首次观察到了双光子激发现象。
激光的出现， 激光的出现，才使拉曼 光谱的检测变得容易
光源： 光源：激光反射镜 样品池：微量池、常规池 样品池：微量池、 单色器 检测器： 检测器：光电倍增管
傅立叶变换-拉曼光谱仪
FT-Raman spectroscopy 光源：Nd-YAG钇铝石榴石激光器（1.064µm）； 光源： 检测器：高灵敏度的铟镓砷探头； 检测器： 特点： 特点： （1）避免了荧光干扰； ）避免了荧光干扰； （2）精度高； ）精度高； （3）消除了瑞利谱线； ）消除了瑞利谱线； （4）测量速度快。 ）测量速度快。
3. 红外活性和拉曼活性振动 ①红外活性振动 永久偶极矩 极性基团； 偶极矩； ⅰ永久偶极矩；极性基团； 瞬间偶极矩；非对称分子； ⅱ瞬间偶极矩；非对称分子；
e
E
r e
红外活性振动—伴有偶极矩变化的振动可以产生红外吸收谱带. 红外活性振动 伴有偶极矩变化的振动可以产生红外吸收谱带. 伴有偶极矩变化的振动可以产生红外吸收谱带 ②拉曼活性振动 诱导偶极矩 诱导偶极矩 ρ = αE 非极性基团，对称分子； 非极性基团，对称分子； 拉曼活性振动—伴随有极化率变化的振动。 拉曼活性振动 伴随有极化率变化的振动。 伴随有极化率变化的振动 对称分子： 对称分子： 对称振动→拉曼活性。 对称振动→拉曼活性。 不对称振动→ 不对称振动→红外活性
Addition of Staurosporine
Cell membrane
1-1 激光基础知识 1-2 激光拉曼光谱分析法 1-3 激光吸收光谱 1-4 激光发射光谱
一、原子发射 二、原子荧光 三、分子荧光
一、原子发射
激光仅用于加热，特点是：所需样 品量少、分析速度快、基体效应小。
二、原子荧光
闪光灯等
2．工作介质 ．
气体（ 气体（如He-Ne，CO2） ， 固体（如红宝石Al2O3） 固体（如红宝石 半导体（ 半导体（如砷化镓 GaAs） ） 染料
3．光学谐振腔 ．
1-1 激光基础知识 1-2 激光拉曼光谱分析法
一、原理 二、仪器 三、应用
1-3 激光吸收光谱 1-4 激光发射光谱
一、原理
原子从高能态跃迁到低能态时， 原子从高能态跃迁到低能态时 ， 发射 出能量为hv=E2-E1的光子，称为光辐射。 的光子，称为光辐射 光辐射。 出能量为
2．粒子数反转 ． 原子数 基态>>激发态 基态 激发态 激发态>基态 激发态 基态
3．激光振荡 ．
激光相关视频来自叶善专大学物理工作室
红宝石激光器
Development and Commercialization of TLM
Desktop-sized TLM ITLM10 (Institute of Microchemical Technology)
In collaboration with Institute of Microchemical Technology, LTD and Kanomax Research Institute Co., LTD.
传统单光子激发存在的问题
• 分辨率低，光通过的路径上分子都有可能被激发； • 样品穿透能力低，例如生物组织对紫外-可见光吸收强， 但是红外染料种类少，价格昂贵； • 光漂白作用明显，尤其是光强较大时； • 高能量的光子，如紫外光，对活细胞的损伤大
hν0 + ∆ν ν
h ∆ν
Raman散射 散射
E0基态， E1振动激发态； E0 + hν0 ， E1 + hν0 激发虚态； 基态， 振动激发态； ν ν 激发虚态； 获得能量后，跃迁到激发虚态 获得能量后，跃迁到激发虚态.
1923年Smekal预测 年 预测 1928年印度物理学家 年印度物理学家Raman C V 发现 年印度物理学家
E1 + hν0 ν E2 + hν0 ν
hν0 ν
h(ν0 + ∆ν ν ∆ν) h ∆ν
ANTI-STOKES
Rayleigh
ν0
ν0 + ∆ν
2. Raman位移 对不同物质： ∆ν不同 不同； 对不同物质： ∆ν不同； 对同一物质： ∆ν与入射光频率无关；表征分子振-转能 对同一物质： ∆ν与入射光频率无关；表征分子振 转能 与入射光频率无关 级的特征物理量；定性与结构分析的依据； 级的特征物理量；定性与结构分析的依据； Raman散射的产生：光电场E中，分子产生诱导偶极距ρ 散射的产生：光电场 中 分子产生诱导偶极距ρ 散射的产生 ρ = αE 为比例常数，即分子极化率； α 为比例常数，即分子极化率；