Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程Protocol No. PT140726-1Protocol No. PT140726-11，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：pGK1.1U6 CACC G CAAA 4 55’ -5’3’-3’ -- ～20bp2，操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。

B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPR Design：/●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”Array根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp 的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2. T4 DNA Ligase连接将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

Protocol No. PT140726-1Protocol No. PT140726-1退火反应体系如下：将以上体系瞬时离心后，置于PCR 仪中95℃孵育3min ，孵育后自然冷却20min 。

取1.75μl 的杂交后的双链DNA 进行T4 DNA Ligase 连接反应，反应体系如下：pGK1.1 linear vector 2μl双链DNA1.75μl T4 DNA Ligase 1μl 10xT4 DNA Ligase Buffer 1μl ddH 2O 4.25μl 10μl※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo 序列和负链Oligo 序列，合成后的2条单链 oligo DNA 退火复性成双链DNA ，再进行T4 DNA Ligase 连接反应。

连接产物可以直接转化DH5a 高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。

3. 电转染靶细胞(推荐)转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg /μl 浓度，再取4～7μg 进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix 细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。

另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

4. 混合克隆pool 检测48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS 洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS 中，煮5min 后模板就制备好了，剩余的pool 细胞冻存。

PCR 检测（以Fut8基因为例）：11步骤所制备的模板 5ulFut8-seq-F(10mM): 1ul Fut8-seq-R(10mM): 1ul dNTP Mixture(10mM each): 1ul Taq 酶： 0.5ul 10XTaq 酶buffer ： 5ul Mgcl 2 3ulH2O: 33.5ul Total 50ul 程序： 95℃ 2min cycles 1x 95℃ 20SX ℃ 20S72℃ 30S72℃ 5min cycles 1x 95℃ 变性 5minPCR 产物使用Cruiser TM 酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。

正链Oligo(100μM) 0.5μl负链Oligo(100μM)0.5μl ddH 2O18μl Annealing Buffer(20x)1μl 20μl}cycles 35x上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。

5. Cruiser TM筛选阳性克隆将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza™(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用Genloci TNA抽提试剂盒(Cat.No.: GL10851S)。

然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用Genloci Cruiser TM突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对Cruiser TM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。

Protocol No. PT140726-1IV．FAQQ-1：靶位点设计有哪些注意事项A-1：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用Zhang Feng lab：/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。

在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。

Q-2：转染效率低，怎么办？A-2：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。

所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。

Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的CTX-1500A电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。

Q-3：单个细胞不生长，怎么办？A-3：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。

共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用Cell Plaza TM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。

如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。

具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。

目前市面上主要有三种错配酶：Cruiser TM酶、T7E I 和Surveyor酶。

其中，Cruiser TM酶和Surveyor酶属于Cel I家族，这两种酶的筛选特异性比T7E I高。

在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐Cruiser TM酶，它特异性高且价格合理。

Protocol No. PT140726-1Protocol No. PT140726-1VI ．附录附录A pGK1.1 linear Vector以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为Bbs I 。

Figure 3. pGK1.1插入位点图示Figure 4. pGK1.1质粒图谱pGK1.1：Protocol No. PT140726-1 Genloci Biotechnologies Inc.VII Cruiser TM 操作说明1，操作步骤1） 基因组 D NA 的准备提取细胞的基因组 DNA ，推荐使用 Genloci 公司专为阳性克隆筛选设计的 TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S ），只需 500 个左右的细胞即可提取全基因组 D NA ，详细实验步骤请参看 G enloci TNA 抽提试 剂盒（Cat. No.: GL10851S ）说明书。

2） 杂交 D NA 的准备a) 第一轮和第二轮（巢式）PCR 引物设计分别设计 F irst Primers 和 N ested Primers 。

其中 F irst Primers 要求具有较高的特异性，其扩增产物推 荐为 500～1000 bp ，Nested Primers 推荐扩增产物长度为 300～600bp 。

First Primers 和 N ested Primers 引物对应目的序列的位置如下：模板 DNA第一轮 PCR 产物第二轮（巢式）b) 第一轮P CR：获得目的片段将已经提取的基因组作为模板，使用F irst Primers，以高保真D NA 聚合酶扩增获得目的片段，要求目的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。

同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。

推荐扩增循环数35～40 cycles，反应体系25 μl，100 ng≤模板量≤300 ng。

PCR 完成后，取7～8 μl 进行电泳检测。

c) 第二轮（巢式）PCR：获得杂交D NA根据第一轮P CR 电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照M arker 的亮度估算产物中DNA 的浓度，稀释至总核酸浓度为10～20 ng/μl，一般需要稀释10～50 倍）。

其中野生型模板扩增产物标记为：WT DNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MT DNA；根据您的检测样本量的大小取合适量的稀释产物作为第二轮P CR 的模板。