植物内生细菌3冯永君①　宋　未②①博士生,首都师范大学生物系,北京100037②研究员,博士生导师,首都师范大学生物系,北京1000373国家自然科学基金资助项目(批准号:39770023)关键词　植物内生细菌　植物微生态学　内共生固氮 植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物,有生物防治、植物促生和内共生固氮作用.在农业生产过程中,由于农药和化肥的大量使用以及农田耕作的单一化,使植物和土壤中微生物的多样性大为减少.在人们日益重视人与自然和谐相处的今天,研究和利用植物内生细菌对于替代或减少农药和化肥的使用,改善农业生态系统,保持植物微生态系统的生物多样性以及维护农田生态平衡实现可持续发展都有重要意义.一、引　言 植物内生细菌名称的由来是经历了几十年的发展才逐渐形成的.起初,人们对健康植物组织中存活的微生物并未引起重视,但后来越来越多的微生物(特别是细菌)从植物的根、茎、叶、穗中分离出来,人们才意识到这些从植物中分离的微生物可能与植物存在某种相互关系.随着对这类微生物研究的不断深入,1992年克洛珀[1]第一次提出了“植物内生细菌”(endophytic bacteria)的概念.植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物.内生细菌在植物体内的定殖是一个主动过程,定殖细胞必须是活的和能增殖的;定殖后的内生细菌不会对植物造成实质性的危害症状[2]. 虽然植物内生细菌概念提出的时间尚短,然而这一概念一经提出就立刻引起了微生物学家、植物学家和微生态学家以及作物学家的广泛关注.首先,这是因为内生细菌概念的提出完全打破了人们对植物组织的传统认识:传统的观念一直认为健康的植物组织内是无菌的.虽然在1992年克洛珀提出内生细菌的概念之前的几十年的发展时间里,已从植物组织内越来越多地分离了许多微生物,但人们还是认为这是一些潜在的植物病原菌,因而始终未引起广泛关注和高度重视.克洛珀总结了前人的工作将这些“内生细菌”作为一个概念提出后,才使人们意识到不得不抛弃以前的所谓“潜在的植物致病菌”的片面性见解,重新面对这个新鲜事物.因而可以说植物内生细菌概念的提出是植物微生物学学科发展的一次革命.内生细菌的研究已成为植物微生态学和微生物学学科交叉的新的生长点. 其次,人们不禁要问,为什么植物体内要含有这些细菌呢?它们的行为是怎样的,有何应用价值?一些初步的研究已经证实,内生细菌在植物体内不仅积极地生存着,而且还能产生多种生物学作用,如固氮作用,促进植物生长作用和对病虫害的防治作用等[3].这些研究结果的公布立即让生态学家和作物学家兴奋起来.人们注意到植物-内生细菌这种和谐共生,互利共栖的生命形式,可能是未来生态型农业发展的一条重要思路.所以,开展植物内生细菌的研究不仅对植物微生物学科的基础研究有重要的理论价值,而且对农业可持续发展也有重要的实践意义.二、植物内生细菌和植物之间的关系 目前关于植物内生细菌和植物之间的关系的认识上,主要有两种观点.一种是传统的观点,认为植物内生细菌是潜在的植物致病菌.研究者从植物病理学的角度着手,研究重心是单个微生物及其致病性,目的在于分离内生细菌,鉴定致病性,阻止其进入周围环境.通过这方面的研究发现,多数植物内生细菌有潜在的植物致病性,它们在侵染健康植物时,不表现实质性的致病症状,但当无病症的健康植物偶然受到来源于生物的或非生物的胁迫条件的威胁,以及受到突然恶劣的环境变化的冲击而造成植物自身的防御功能严重削弱时,一部分内生病原菌就会活跃地生长起来,引起植物的病害. 另一种观点认为,植物内生细菌与正常生长状态的植物之间是和谐共处的关系.研究者从植物体内的微生态学的角度着手,研究重心是植物与内生细菌群之间的相互关系,目的在于探索内生细菌在植物体内的生物特性,以及与植物的相互关系和生物学作用,研究这种和谐关系,以期将其应用于农业.持这一观点的人认为,传统的所谓“潜在的植物致病菌”的说法,只是在植物处于极端不正常的状态下才会出现,因而对通常处于健康生长的植物来说,不具有普遍意义.目前,后一种观点已为大多数人接受.三、植物和内生细菌的微生态系统 植物体本身可以看作是一个复杂的微生态系统.在这个系统中,多种微生物能与植物形成营养和竞争的小社会.该系统中的栖息者就是各种各样的细菌,包括准备侵染的植物体外的外围细菌,也包括正在溶透植物组织和已经定殖的内部细菌.不同的内生细菌占据不同的生态位,在这个植物微生态系统中,各种不同的细菌之间能建立一种动态的平衡体系[4].生物多样性是构成生态系统的基本条件.就微生物的数量而言,可分为优势种和稀有种.它们有些是有益的,有些是中性的,有些是有潜在危害的.众多的稀有种和几个优势种是构成微生态系统的生物因素.内生细菌与内生细菌之间,内生细菌与宿主植物之间的充满和谐与竞争的微生态系统是在长期系统发育过程中共进化的结果. 除了来源于种子外,大部分内生细菌的定殖起源于种子发芽期.在幼苗期植物能产生许多能为各种微生物识别的信息分子,如类黄酮类物质等,尽管宿主相关性微生物、腐生细菌和寄生细菌等都能识别这些信息分子,但只有与宿主“亲合性”最强的微生物能占据根际位置,并阻止其他特异性较差的定殖者的进入.这就是用植物根际促生细菌(plant growth2prom oting rhizobacteria, PG PR)接种到作物上进行生物防治达到增产效果的原理.当内生细菌在植物根外附着后就开始侵入宿主:进入宿主是避免外部激烈竞争的一个行之有效的途径.最后进入宿主的才是侵染过程的真正胜利者. 需要指出的是,不同内生细菌进入植物体内后仍然存在种间竞争,直到重新创建一个相对稳定的平衡体系.这样一来,植物体就可以看作是一个由自身的活体组织和定殖在体内的内生细菌共同构成的生态体系.在植物生活史的整个过程中维持动态的平衡.因而,内生细菌生态学的研究内容不仅包括微生态环境的组成,而且要特别重视时空条件变化时它们之间的关系变化.微生物之间的关系有竞争关系,也有可能形成营养代谢链,但优势微生物可能会更好地利用营养物质.四、内生细菌的侵染和定殖 一般说来,内生细菌一旦进入植物体内就寻找适于自己生存的植物组织(更确切地说是组织的细胞间隙或细胞内)定殖下来,而不是在整个植物体内的各种组织间到处扩散.内生细菌选择定居点的原则是:一是没有其他内生细菌的干扰;二是能满足自己的营养需要.内生细菌可以很容易地穿过植物皮层进入木质部导管中,随着植物的生长可以将内生细菌运送到植物上部营养器官或繁殖器官中.有些内生细菌定殖在植物种子内,称为“种生内生细菌”.它们成为下一代植物新植株内生细菌的重要来源.有些内生细菌可以再回到空气中,通过空气运动重新分布到植物叶茎等处,再通过气孔、水孔、皮孔等回到植物体内.内生细菌也可以通过介壳虫以及其他一些昆虫的协助进行传播和再分布.另外,植物内生细菌还可以由根际真菌的携带达到侵染和重新分布的目的. 因此不难看到,内生细菌侵染植物并建立微生态系统不是被动的偶然的过程,而是个主动的过程,只有那些经常(而不是偶然的)可以从某些宿主分离到的内生细菌,才是真正意义上的内生细菌. 根据植物与内生细菌的关系可以将内生细菌分为专性内生细菌和兼性内生细菌.大多数内生细菌属于兼性内生细菌.因为它们除了能在植物体内存活外,还可以在根际或土壤中存活.但也有些是专性内生细菌.如腐烂棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)是甜菜专性内生细菌,织片草螺菌(H erbaspirillum seropedicae)、红苍白假单胞菌(P seudomonas rubrisubalbicans)是玉米、甘蔗、高粱等植物的专性内生细菌.它们不能存活在植物组织外部,而只能在活植物组织或残体中存活,跟随植物的整个生活史而存活,并通过种子传播到下一代.内生细菌在植物体内存活的持久性如何,是长期居住还是短期居住,是存在于植物的整个生活史,还是生活史的某一阶段?这些特征的关键在于它们对宿主环境的适应性如何,适应性强则生存时间长.根据宿主专一性的不同,又可以将内生细菌划分为专一宿主内生细菌和多宿主内生细菌.虽然似乎可以从多种宿主上分离到同一种内生细菌,但并不是说内生细菌是无专一性的.因为宿主专一性的问题很大程度上是菌株水平上的专一性,而不是菌种水平上的专一性.宿主专一性的实质是内生细菌与宿主和谐性的问题,是内生细菌应用研究中最重要的问题之一.五、内生细菌在农业上的应用 植物内生细菌的应用价值可以归结为生物防治作用:促生作用和固氮作用.植物体转入一些内生细菌后,就能抵抗某些鳞翅目和线虫等的入侵.促生作用可以分为直接促进植物生长(通过产生植物激素或固氮作用)和间接促进植物生长(通过抗植物致病菌等)两种情况.1.生物防治病原菌 从百慕大草中分离的木质棍状杆菌犬齿亚种(Clav2 ibacter xyli subsp.cynodontis)接种到一些植物上后可以很快侵染到整个植物体中.利用这一特点将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的伴胞晶体编码基因转移到这种内生细菌中,实现了对欧洲玉米螟的生物防治[5],减少了化学农药的使用.将苏云金杆菌基因转入蜡状芽孢杆菌(B.cereus)内,实现了对两种鳞翅目昆虫的防治[6].利用从棉花中分离的内生细菌对棉花枯萎病进行防治也有了成功的例子.克洛珀等[7]也用内生细菌防治了植物致病性线虫.我们利用从水稻中分离的几种内生细菌进行了研究,发现它们能很好地诱导水稻对白叶枯病的抗性[8]. 用内生细菌进行生物防治的原理,主要是有些内生细菌在植物体内可以产生一些抗生素对病原菌有拮抗作用.有些内生细菌能产生杀菌蛋白,也能起到杀灭病原菌的作用;有些内生细菌能产生几丁质酶,可以裂解真菌性病原菌的细胞壁从而起到生防作用.除了上面提到的特异性抗生物质外,内生细菌的生物防治作用还有非特异性一方面,即内生细菌定殖在植物体内实际上是占据了植物上的生态位点.由于位点和生存空间的限制,就阻止了病原菌的入侵和定殖.内生细菌还可以与病原菌形成营养竞争的对抗关系,使病原菌因得不到正常的营养供给而消亡.2.促生作用 研究表明,有些植物内生细菌能产生植物促生物质,如植物激素等.在这方面研究最多的是吲哚乙酸.假单胞菌属,芽孢杆菌属等都能产生分泌吲哚乙酸或赤霉素,草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)不仅能产生吲哚乙酸,而且还能产生细胞分裂素.这些物质都能有效地促进植物的生长.从墨西哥分离的18株重氮营养醋杆菌(Acetobacter diazotrophicus)[9]都有产生生长素的能力.表明重氮营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮,而且还可以通过生长素的调节作用影响植物的代谢,促进植物生长.最近,我们的一项研究表明,产酸克雷伯氏菌(K lebsiella oxytoca)产生的生长素对水稻植株的生长和发育起着重要的调节作用[10].3.生物固氮作用 人们对内生细菌的生物学作用方面最感兴趣的莫过于其内共生固氮作用.目前关于非豆科作物的共生固氮问题的研究,主要有两种思路.其一,利用根瘤菌能够被一些非豆科作物的根毛吸附的特点,在人为条件下使之形成类似根瘤的结构,实现非豆科作物的共生固氮;其二,将固氮基因及相关基因引入禾本科作物使其能自主固氮.这两种思路虽然有一定的可行性,但都存在巨大的困难:经过这种对植物微生态系统和代谢系统的人为改造后,宿主植物需要将很大一部分能量用于固氮作用,从而严重破坏了植物对微生态系统和代谢系统正常的自我调节作用,结果是不但不能促进植物的生长,反而抑制了植物的生长.研究发现,很多植物内生细菌可以从空气中吸收氮气,并将其固定为化合态氮,这为人们研究非豆科作物共生固氮又提供了一条新思路.这是因为内生细菌与宿主植物之间的充满和谐与竞争的微生态系统,是在长期系统发育过程中共进化的结果,能在最大程度上受到植物整体水平上的调节.固氮内生细菌与植物之间无论在微生态学上还是在代谢上是一种和谐联合的关系.固氮内生细菌能利用植物产生的多余的能量发挥固氮作用,但又受到植物的这种长期共进化过程中形成的调控系统的宏观调节,植物能始终处于相对较为主动的地位.因而,有效地发挥非豆科作物内生细菌的共生固氮作用,在一定程度上可以取代或减少化肥的使用.在巴西和菲律宾,虽然连年不施氮肥,但甘蔗和水稻依然能获得较高的产量.研究认为,就是由于甘蔗和水稻体内的内生固氮细菌为其提供了氮素.这里需要强调的是,固氮内生细菌的内共生固氮与根瘤菌的共生固氮是不同的.前者不形成特化结构,几乎可以在宿主植物的各种营养器官内发挥固氮作用;而后者必须在宿主植物的特定器官上形成根瘤,才能发挥固氮作用.共生体的宿主特异性要强于前者. 固氮内生细菌可以划分为兼性固氮内生细菌和专性固氮内生细菌[11].前者无论在根表、根内还是在土壤中都表现出活跃的生存状态,而后者在根内或茎叶等部位定殖,但在土壤中存活困难.同兼性固氮内生细菌相比,专性固氮内生细菌不能在植物组织外部生存,但是可以随着宿主植物的生物循环通过种子、种子萌发产生的新组织和植物新植株进行散播.另外,兼性固氮内生细菌可以侵入并定殖到植物内部组织,但与专性固氮内生细菌不同的是,它们能在植物组织外部存活一定的时间.从植物中分离的固氮螺菌属(Azospirillum)、草螺菌属、重氮营养醋杆菌和成团泛菌(Pantoea agglomerans)等,都有固氮活性,并已在温室或大田里进行了实验.我们对水稻“越富”品种的研究表明,仅在这一种水稻中分离的具有固氮活性的细菌就涉及到9个属的14个种[12].其分布是十分广泛与普遍的.有固氮活性的重氮营养醋杆菌能定殖在热带禾本科植物的体内,利用高蔗糖浓度的半固体培养基可从甘蔗根和茎中分离到重氮营养醋杆菌、虽然偶尔也能发现该菌在甘薯等其他植物上生长定殖,但是分离起来往往十分困难[13].织片草螺菌等几种草螺菌属于固氮内生细菌,织片草螺菌能在许多禾本科植物上定殖.重氮营养醋杆菌和草螺菌属的几种内生细菌却不能从没有耕种过这些作物的土壤中分离.这些细菌也不能较好地在土壤中存活.用高梁种子发芽培养的方法,可以在土壤样品中捕获到织片草螺菌.说明高粱苗释放的物质激活了土壤中那些活的但处于不可培养状态的细菌[14].用水稻进行的一项初步研究表明,水稻能产生一种分子结构类似于类黄酮(豆科作物根瘤形成时产生的信息分子)的化合物.与重氮营养醋杆菌相比,草螺菌属的细菌在环境中还有其他一些不同的传播方式.其中最重要的是后者可通过谷物的种子传播.但是两者在植物中的生长与增殖过程是相似的. 研究还发现,在不同基因型的甘蔗体内,同一固氮内生细菌的固氮活性明显不同.说明植物的遗传因子对内生细菌生物固氮过程的效率有影响,但是目前关于植物基因型与内生细菌相互作用的研究尚未深入展开.用免疫学方法进行的显微观察已证明,重氮营养醋杆菌和草螺菌属的几种内生细菌主要定殖在甘蔗根部和的其他地上部位.另外,用免疫金标记技术证明,在甘蔗的叶细胞间隙和高粱叶的原生木质部有草螺菌的固氮活性.在重氮营养醋杆菌PA L5侵染的甘蔗茎的基部检测到固氮酶的活性,但同时用固氮基因nif D缺失突变体侵染的甘蔗却没有检测到固氮酶活性.为了弄清植物的基因是如何受相关固氮内生细菌诱导表达的,最近用ddRT-PCR技术分离了一段基因[15].根据这段基因可以推出它所编码的蛋白质M isA2的序列.M isA2的序列与已知蛋白质数据库内的所有蛋白都不表现同源性,但M isA2富含脯氨酸.这个特点却与在根瘤菌侵染线内的植物细胞壁上与根瘤形成有关的泊位蛋白很相似.还分离到另一个基因,它所编码的蛋白称做AcA5,与酵母内体膜同源性较高,在草螺菌侵入到甘蔗体内后,总是要形成一层包围在菌体外的膜状结构叫做外周膜,AcA5可能与外周膜的形成有关.尽管根瘤菌-豆科作物,固氮内生细菌-甘蔗的共生过程形成的结构迥异,但是它们都能形成外周膜结构.可能有完全相似的侵染和定殖机制,关于这一问题需要进一步的研究证实.六、结束语 由于农药和化肥的使用以及农田耕作的单一化,使植物和土壤中微生物的多样性大为减少.研究植物内生细菌对于重新建立植物体内细菌的多样性,保护植物减少来自环境和虫害的压力,为植物提供氮肥和植物促生有重要作用.在人们日益重视人与自然和谐相处的今天,植物-内生细菌这种和谐联合的生命形式,为未来生态型农业发展提供了一条重要思路.它对于替代或减少化肥和农药的使用,改善农业生态系统,保持植物微生态系统的生物多样性,以及维护农田生态平衡实现农业可持续性发展将起到重要作用.(2001年3月20日收到)1　K loepper J.W.,Beaucham p C.J.Can.J.Microbio L,1992;38:12192 i2322　M ishagi I.J.,D onndelinger C.R.Phytopathol.,1990;80:80828113　Fiore S.D.,G allo M.DE L.Endophytic bacteria:their possible role in the host plant.In:Fendrik,I.eds.Azospirillum VI and related microor2 ganisms.Berlin:S pringel2Vefiag,1995:16921874　Fisher P.J.,Petrini O.,Lappin Scott H.M.New 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and②Pro fessor,Supervisor o f Ph.D.Candidates, Department o f Biology,Capital Normal University,Beijing100037K ey w ords　endophytic bacteria,plant microecology,endosymbiosis nitro2 gen fixation。