收稿日期: 2005-11-14; 修回日期: 2006-02-15 基金项目: 广东省自然科学基金团队项目(编号: 2004E039213)[Guangdong Natural Science fund Teamitem (No. 2004E039213)] 作者简介: 苏惠霜(1981－), 女, 吉林人, 白族, 硕士研究生, 研究方向: 基因工程制药学。Tel: 13560178062; E-mail: shsh589@ 通讯作者: 王一飞(1963－), 男, 河南人, 教授, 博士, 研究方向: 基因工程制药学。Tel: 020-852227064856
基因工程药物的作用原理如图 1 所示, 所以基因 转移运载体系必须解决以下问题: (1)确定目标细胞 的转移运载体系; (2)通过细胞膜的传输; (3)内溶酶体 的吸收降解; (4)在细胞内质粒DNA到细胞核的输送。 最关键的问题是如何选择合适的载体对病变组织有 选择性且能高效率协助目的基因进入目的细胞的低 毒基因载体 [3]。但是, 壳聚糖用于基因传染载体由于 它的低转染效率而受到限制。
3.1 改构修饰后提高转染效率
3.1.1 咪唑丙烯酸修饰的壳聚糖
为了提高转染效率, 可溶性壳聚糖与 UA(咪唑 丙烯酸)连接, UA 中的咪唑环可以通过质子海绵机制 在内涵体破裂过程中起重要作用。UA 修饰的壳聚糖 (UAC)与 DNA 结合, UAC/DNA 复合物在生理条件下 (109~342 nm)和壳聚糖/DNA 复合物的粒子大小几乎 是一样的。UAC 也表现出很好的 DNA 结合能力, 保 护 DNA 受核酸酶侵袭的能力, 并具有低毒性。与 UA 连接后壳聚糖在 293T 细胞中的转染效率明显提高, 并且随着 UA 在 UAC 中的含量的增加, 转染效率也 增高 [12]。
10 期
苏惠霜等: 壳聚糖作为基因药物载体的研究进展
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导的基因表达被血清屏蔽了, 但是壳聚糖表现出对 血清有抵抗力 [9]。
质粒/壳聚糖复合粒子的转染活动和细胞吞噬之 间的关系是通过用荧光素 Isothiocyanate 标记的质粒 和Texas红标记的壳聚糖来分析的。有很多因素影响 转染活动和细胞内吞, 例如: 壳聚糖的分子量和脱 乙酰度, 复合粒子的化学计量, 血清浓度和转染介 质的pH等。当壳聚糖的分子量为 40 或者 84 kDa, N/P 比为 5, 转染介质含有 10%血清且pH为 7.0 时, 质粒/ 壳聚糖复合物的转染水平最高 [10]。
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的脱乙酰衍生物, 它 是一类由 2-氨基-2-脱氧葡萄糖通过β-1, 4 糖苷键连 接而成的带正电荷直链多糖 [2]。壳聚糖能够增加药
物
运输过细胞膜的量, 它的阳离子聚合电解质本身提 供了与粘液, 阴离子表面, 和其他巨大分子如 成为生物医学和制药学中很受关注的多聚物。
Key words: chitosan; transfection; non-viral gene delivery; mechanism
壳聚糖是无毒、生物相容性好的多聚阳离子, 并 且有较低的免疫源性。它是基因传递系统好的选择, 因为它带有阳离子可以和带有阴离子的 DNA 有效的 结合, 并且保护它免受核酸酶的降解。它有利于在准 备期内不需采用超声波生物降解和加入有机溶剂, 因此使配位过程中 DNA 可能受到的破坏最小化。而 且装载 DNA 的壳聚糖微粒在储存时较为稳 定 [1], 所以用壳聚糖作为基因药物的载体具有重大 意义。
6: mRNA 表达; 7: 蛋白质表达。 Fig. 1 Simplified gene therapy mechanism A: Extracellular trafficking; 1: Insertion of the gene in the vector; B: Internalization contact and crossing of the cell membrane; C: Intracellular trafficking; 2: Uptake of the vector complex into intracellular endosome; 3: Complex release from the endosome into the cytoplasm; 4: Uptake of the complex in the nucleus; D: Gene expression; 5: DNA dissociation from the vector; 6: mRNA transcription from the gene; 7: Protein translation from the mRNA.
关键词: 壳聚糖; 转染; 基因载体; 机制
中图分类号: Q78
文献标识码: A
文章编号: 0253-9772(2006)10-1321-04
Progress in Research of Chitosan as a Non-viral Gene Delivery Vector
SU Hui-Shuang, WANG Yi-Fei
1 基因-壳聚糖纳米粒的制备
制备基因-壳聚糖纳米粒, 目前用得最多的方法 是复凝集法: 将分别装有一定体积壳聚糖溶液(450 μg/mL, pH 5.5)和等体积DNA溶液(120 μg/mL, 含 10 mmol Na2SO4)的Ep管置于 55℃水浴恒温 30 min, 将 两者迅速在旋涡混合器上混合 30 s, 即得基因－壳 聚糖纳米粒混悬液。还有一些其他方法如: 公价交联 法, 大分子复合法, 自组装法等 [2]。
3.1.2 PEG 化壳聚糖
由于壳聚糖分子间氢键的存在, 使它不溶于一 般的有机溶剂和水, 而且由于其疏水性, 所制成的 DNA 给药系统易被网状内皮吞噬系统(Reticuloendothelialsystem, RES)所吞噬。为了改善其水溶性, 延长壳聚 糖/DNA 自组装复合物在长循环中的停留时间, 我们 通过接枝共聚的方法将亲水无毒的聚乙二醇链段引 入壳聚糖的氨基侧链上, 得到了改性的壳聚糖-聚乙 二醇接枝共聚物, 流式细胞仪测得, PEG 化壳聚糖 /DNA 自组装复合物在 HeLa 细胞体外转染率达到 81%[13]。
复合粒子的大小对细胞的内吞作用是很重要 的。小的复合物粒子通过细胞内吞作用和/或者胞饮 作用进入细胞时有优势, 因此可以提高转染率。复合 物的大小受壳聚糖的脱乙酰度, DNA的浓度, pH值和 电荷比例的影响 [4]。
壳聚糖/DNA 的电荷比例对粒子大小的影响: 当 壳聚糖/DNA 的比值增加时, 复合粒子的大小降低, 当比值是 5 时, 有一个最小有效值 120 nm, 并且在比 值为 5~20 之间的粒子在粒子大小上没有什么大的差 别 [5]。当CS/DNA大于 1/2 时, 复合物即失去了在电 场中向阳极泳动的能力, 表明DNA所携带的负电荷
(Biomedicine R&D Center, Jinan University, Guangzhou 510632, China)
Abstract: Efficiency of non-viral gene delivery based on chitosan and chitosan derivatives as DNA condensing carrier is dependent on a series of factors, such as complex size, the charge ratio of chitosan/DNA, molecular mass of chitosan, the degree of chitosan deacetylation, pH and serum concentration of the transfection medium. Through modifying the chitosan in a certain extent, we can change the efficiency of transfection. Studies on transfection condition, efficiency and mechanism using chitosan and chitosan derivatives as transfection agents are reviewed.
3 转染效率研究
活体中的转染效率是细胞种类依赖性的, 而且 在与纳米粒共同抚育后的细胞的生殖能力研究中也 确实了, 壳聚糖的毒性比脂质体等脂类小。
pGL3/壳聚糖复合物的转染效率依赖于培养基 的pH, pGL3/壳聚糖的化学计量, 血清, 和壳聚糖的 分子量。转染效率在pH为 6.9 时比 7.6 时高。最适合 的电荷比例pGL3 壳聚糖为 1:5。15 和 52 kDa的壳聚 糖聚合体很大的提高了荧光素酶的活性。100 kDa的 壳聚糖介导的转染效率低于 15 和 52 kDa的壳聚糖。 七聚物(1.3 kDa)没有表现出任何基因表达。脂质体介
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遗 传 HEREDITAS (Beijing) 2006
28 卷
图 1 基因治疗的简单机制
A: 细胞外攻击; 1: 基因与载体结合; B: 跨过细胞膜; C: 细胞内攻击; 2: 载体复合物被吸收到细胞内包涵体中; 3: 复合物从包涵体释放到 细胞质中; 4: 细胞核吸收复合物; D: 基因表达; 5: DNA 与载体分离;
2.2 DNA 的形态影响
我们的结果表明在形成复合物的时候, 当开环 和成碎片的直链的形式增加时, 超螺旋的形式就会 减少。通过复凝集法形成的DNA壳聚糖纳米微粒, 有 效的保护了超螺旋形式的pDNA。在pH值为 5.5, 保 存 3 个月之后, 纳米粒子的大小和zeta电位没有任何 大的改变, 但是加入防冷冻剂冻干的粒子的大小就 发生了变化 [7]。
遗 传 HEREDITAS (Beijing) 28(10): 1321~1324, 2006