从患者开始谈基因检测的整个流程题记：几颗玉米放进爆米花机器，出来便是爆米花；一个智力一般的高中生放到人大附中，三年后出来就是国际一流大学新生；二两五花肉和几个青椒交给一名厨师，出来的便是香喷喷的回锅肉。
可是这中间都发生了啥是什么重要步骤将初始原料打磨成了成品10ml 的血液或者一块肿瘤组织，最终变成了一份20 页的检测报告这是怎么实现的中间都发生了什么本文旨在回答这个问题。
基因检测的整个流程可分为哪几个大的步骤概况性地了解一个事务的框架是很有必要的，因为这样我们心里会有“底”。
不管别人怎么分，我简单粗暴地把它分为四个程序：1，检测前咨询部分；2，实验室部分；3，信息分析部分；4，临床解读部分。
五脏俱全的基因检测公司应该包含以上所有的四个程序，除非存在部分业务外包的情况，例如有的公司只做临床解读部分。
1）检测前咨询部分：不是所有的癌症患者都应该检测，都值得检测，检测目的是为了明确是否可以使用靶向药物，还是仅仅为了玩，选择哪种产品更加适合，这些都是需要在这部分搞清楚。
2）实验部分：应该取多少组织样本，测序过程中有哪些细节步骤，这可是个核心环节。
3）信息分析：实验部分做完以后所得到的是一大堆序列，不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是从这些垃圾中挑选黄金。
4）临床解读：黄金挑选出来不拿去换成大米然后进肚，那也没什么用，基因检测的结果有什么意义，对临床实践又何指导，全在这里了。
四个程序，每个程序又包含哪些小工序呢通过上面的介绍，我们可以大体了解基因检测分为四个程序，也明白四个程序主要做什么。
可是，每一个程序又具体涉及哪些小程序呢剖析程序的过程，就是知识差异化的过程。
1，检测前咨询：患者预期、产品选择；2，实验部分：样本获取与运输、DNA 制备与文库构建、质控与上机测序；3，信息分析部分：数据分析、报告初稿；4，临床解读部分：检测报告、临床实践、报告解读/人文关怀。
总而言之，简单来说，从明确患者的检测目的开始（用药指导，耐药后寻找新的方案，仅检测一个基因或多个基因突变状态等），到选择合适的产品，然后获取规范的样本（血液，组织，唾液等），然后合适的运输方式到达实验室，然后一些列的规范实验室操作及数据分析，最后到科学的检测报告与咨询服务。
这就是四个程序所包含的内容。
每一个程序分为许多小工序，每一个小工序又有许多学问与讲究。
下面将会详细介绍每一个小工序。
程序一：检测前咨询部分：患者预期。
销售经理、产品经理、主治医生与患者需要充分沟通，明确该基因检测的目的，知道检测技术的局限性，做好患者的预期控制。
：产品选择。
对于基因检测产品来说，产品选择几乎等同于检测基因的选择。
哪些基因需要强行检测、哪些基因推荐检测、哪些基因有一定的检测价值，这些需要阐述清楚。
最后，根据患者的经济情况与病情，综合选择（这是理想状况）。
实际操作过程中，销售经理往往会以经济利益为导向。
：临床信息。
患者的临床信息对于基因检测报告者有重要意义，信息掌握越全面报告越个性化，咨询解读也更有针对性。
因此，完整详实的临床申请单需要提供。
程序二：实验部分：样本类型。
需要明确一点，能够运用无创的尽量用无创（唾液与血液），因为没有一个患者希望无缘无故的在自己身上打洞。
固体：手术样本，穿刺样本，石蜡包埋组织，石蜡切片组织；液体：全血，血清血细胞，胸水，腹水，唾液。
1）手术样本：（肿瘤组织》50mg,癌旁正常组织》25mg,收到组织后立即用至少 5 倍体积的10%中性福尔马林固定液固定），切片25张以上，厚度5卩m，肿瘤细胞占比》50%, 坏死组织区域2）穿刺样本：穿刺一针以上，肿瘤细胞占比 > 50%，坏死组织区域3）石蜡包埋组织：常温保存运输即可，最好是1 年以内。
4）石蜡切片组织：常温保存运输即可，最好是6 周以内。
5）全血：6ml-10ml for NGS （Streck 管，含有保存液，负压真空抽满），轻轻垂直平面90°旋转10 次，6-25 C （常温）运输，3 （7）日内送达，可用干冰/制热剂制造维持环境温度。
6）血浆血细胞（普通试管）：抽血后2h 内将全血4C 1600g离心10min，分别收集上清和沉淀至离心管中；上清再4°C 16000g 离心10min ，收集上清血浆转移至15mL 离心管中。
血浆血细胞样品，均封口膜封口，干冰运输。
7）胸水：8）腹水：这两个情况比较少，至少我们公司很少遇到这样的样本。
：质控。
血液样本是否合格，是否可以进行测序上机，样本质量怎么样安捷伦2100 生物分析仪或者4200 TapeStation 核酸分析仪，通过DNA 完整值（DIN ）来数字化基因组DNA 的完整性。
如果不用这些仪器，可以通过跑胶来实现这一步。
质控不合格，只有重新采样。
标准流程只需要卩g DNA , DNA的0D 260/280在之间，RNA 的RIN值》。
实验中发现，只要RIN值大于7,就可以获得比较满意的结果。
（RIN ：RNA 完整值）。
总的来说，质控两个指标：1）足够的DNA 量；2）完整的DNA 基因组。
这个步骤在构建文库后上机测序前完成。
：文库构建。
简而言之，获取足够量的/目的的/前期适合上机测序而标准处理的DNA 。
其程序主要有：片段化，连接，扩增。
1）片段化：我们总不能直接将那么长的DNA 去测序吧，测序仪就只能一次测几百bp 的DNA ，超声波片段化等方法，获得DNA 片段为正态分布200-500bp ，通过一定方法（切割琼脂糖凝胶电泳条带）选择所需长度的DNA片段（150-200bp），其它的片段就扔了（不影响覆盖范围）。
2）末端修补：上面的方法（物理方法）片段化的DNA ，一般来说两端都被破坏了，不再是平平整整的了，而后续步骤需要在两端加测序接头，所以我们得先把这个破坏的两端修补好。
修补所需三种酶：5‘端延伸的酶，5'端连接的酶，3‘端延伸的酶。
3）3' 端加A ：片段化且两端修补好的DNA ，3‘端加上一个碱基A，而下一步骤的连接接头3'端有一个碱基T,这样就实现了碱基互补而连接起来了。
这样做还有以下几个原因：提供连接效率；防止接头与DNA 片段多种方向连接；减少接头之间的连接。
值得一提的是1）2）3）的步骤可以用WGSFramentation Mix 搞定。
4）两端加接头：首先明确接头3‘端有一个突出的碱基T,插入片段3'端有一个突出的碱基A ; 其次，这个工序是在插入片段两端加入东西；这个东西包括以下几个部分：测序接头（P5, P7;测序时用于与种植在Flow Cell 上的序列碱基互补配对用），Barcode（用于标识该条DNA 片段属于哪个样本，4 个碱基），单分子编码序列（Index ，用于识别是哪条DNA 片段，12 个随机碱基） ;其中Y 型的序列是已经商业化的试剂盒。
5）PCR 富集：如果样本不够，那么我们就需要扩增它才能上机测序，这就是该环节存在的必要。
由于每个经4）处理的片段两端都有P5与P7,因此PCR 引物只需设计与它们配对的就行了。
如果样本足够，这一步就省了呗。
6）文库定量：这里才应该是质控，也就是的步骤。
7）基因捕获：我们只将需要的DNA 片段去测序，不需要的去测不是浪费钱吗于是在测序之前，我们就用这个工序将目的DNA 挑选出来（为什么要捕获） ;目前目标序列捕获方法有3 种，NimbleGesn Sequence Capture array，Agilent SureSelect DNA Capture Array ，Agilent SureSelect TargetEnrichment System ，值得注意的是不同捕获方法可能测序仪器有不同的要求（捕获的方法有哪些；罗氏和安捷伦）；我们捕获的探针设计可以自己设计，初步设计，需要检测的位点提交到商业公司，真正的设计还是需要专业的商业公司来干（捕获探针的由来）；例如目标区域为100Kb ，好的探针是100%覆盖这100Kb ，而有的商业公司达不到，只能覆盖到97% ，那么意味着有3%的区域捕获不到，更谈不上对这些区域测序了，所以覆盖率很重要；对于这100Kb 的目标片段，前10Kb 探针捕获了100 个片段，第10Kb-20Kb 的探针捕获了10 个片段，那么这样的话就是均一性不好，最终可能会得出结论10Kb-20Kb 这一段突变频率过高/过低，因此均一性很重要；如果一个探针设计出来想捕获目标片段，却捕获到了别的垃圾片段，我们还对它测序，这不是浪费钱吗所以，探针特异性很重要。
（好的捕获是怎么样的）。
8）PCR 扩增：PCR 再次扩增捕获的DNA 片段，上机前再一次加足样本量。
9）文库再次定量：相当于上机前的再一次质量检测。
：上机测序。
通过前面的步骤，我们从患者身上的一块肿瘤组织或者一管血开始，然后分离提纯我们需要的基因组DNA ，再把这些DNA 打成小片段，然后再在这些DNA 小片段两头接上识别标记和测序接头，最后再通过基因捕获技术筛选出目的DNA ，根据需求PCR 扩增。
通过这么多步骤，就是为上机测序做准备。
一句话，上机测序的过程就是读取这些DNA 小片段的序列，如ATCTGGCTT...(~160bp) ，这样万级、亿级的DNA 片段个数。
至于这些DNA 片段是怎么样在机器上被测出来的，这又是个大问题，我在《液体活检有哪些》这篇文章有简要说明，这里不管它，毕竟世界上那么多事情，哪有想管就管得了的呢至此，实验部分结束。
程序三：信息分析部分：下机数据识别。
数以亿计的DNA 小片段，一大饼，杂乱无章，很多情况是几十个患者的样本都一起的，更乱。
一句话，这个步骤将属于不同患者的DNA 小片段放进不同的盒子里，分类。
这是怎么实现的呢我们在构建文库的加接头步骤时，同时加上了Barcode 序列，同一个患者使用同一个Barcode,不同的患者使用不同的B arcode,那么计算机通过这个Barcode 轻松识别然后放进不同的盒子里。
值得注意的是,DNA 是两条链, 有的公司会两条链同时测序以增加准确性,因此一个 A 患者会有两个盒子属于他( A1 ：正义链的DNA 小片段集合；A2 ：反义链的DNA 小片段集合) 。
还值得注意的是,如果样本是血液, 有的公司会同时检测cfDNA 和gDNA ,那么一个B 患者就会有四个盒子属于他 (B1, B2, B3 , B4 )。
图像转换。
下机的时候那些DNA片段最初其实是图像格式的，例如红色表示碱基A，绿色表示碱基T，需要用专业工具将图像格式转换成序列。
Illumina 公司提供专业软件，只需对其调用就可以完成这一步骤。
一句话：图像转换成序列。
：比对到基因图上。
将这些上以亿级的DNA 小片段归位，如果你是1 号染色体的第500 位到第650 位之间的片段，就把你归到这个位置下面。