牛奶中部分成分的分析1.实验目的1.1设计合适的实验方法来分析牛奶中蛋白质与钙的含量1.2学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白1.3熟悉可见光分光光度计的操作。

1.4加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼。

1.5掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。

1.6掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法。

1.7通过与牛奶包装上注明的含量比较，学会对自己实验分析结果进行客观评价。

2. 实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g·L-1。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。

在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。

操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。

除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。

缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。

补钙越来越被人们所重视。

牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。

对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。

考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA 滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

3. 实验步骤3.1 主要原料和仪器3.1.1材料新鲜牛奶、加钙牛奶3.1.2试剂95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuSO4·5H2O、酒石酸钾、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、钙指示剂3.1.2.1 0.5 mol·L-1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液先配A液与B液。

A液：0.5mol/L醋酸钠溶液。

B液：0.5mol/L醋酸溶液。

A液：4.1g醋酸钠，加水至100ml定容；B液：2.85ml醋酸，加水至100ml定容取A液50mL，B液50mL混合即得pH4.7的HAc-NaAc缓冲液100mL。

3.1.2.2乙醇—乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）95%乙醇和乙醚各25ml3.1.2.3 NaOH（6mol·L-1）：称取24g氢氧化钠溶于100mL水中。

3.1.2.4双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0g，酒石酸钾9.0 g和碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，加6 mol·L-1NaOH l00mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

3.1.2.5 0.9％NaCl（即生理盐水） 1.8g NaCl 200ml水3.1.2.6蛋白质标准液(10mg·mL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。

3.1.2.7待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。

（如若不能溶解，滴加几滴6mol·L-1NaOH 溶液、分别用l0mL容量瓶定容），量取30.00ml纯牛奶，倒入100ml容量瓶中，定容。

3.1.2.8EDTA(0.01mol·L-1)：称取2.0g EDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至500mL，储存于聚乙烯塑料瓶中。

3.1.2.9CaCO3标准溶液(0.01 mol·L-1)：准确称取基准物质CaCO30.1g左右，先以少量水润湿，再逐滴小心加入6 mol·L-1HCl，至CaCO3完全溶解，定量转入100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，并计算其浓度。

3.1.2.10 NaOH（5 mol·L-1） 20g NaOH 100ml 水3.1.2.11 HCl（6 mol·L-1） 50ml 浓盐酸（12mol/L）50ml水3.1.2.12三乙醇胺(200g·L-1) 20g 三乙醇胺 100ml水3.1.2.13铬蓝黑R(5 g·L-1)乙醇溶液 0.5g 铬蓝黑R 100ml乙醇3.1.2.14注意：本实验中需要准确称量的物质质量：0.2 mol·L -1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、蛋白质标准液(10m g·mL -1)、锌标准溶液（1.00µg·mL -1）、双硫腙四氯化碳溶液；要准确量取的溶液体积：牛奶的用量、EDTA(0.01mol·L -1)、蛋白质标准液、待测蛋白样品、0.9%NaCl 、双缩脲试剂、铁标准溶液、盐酸羟胺溶液、邻二氮菲溶液、醋酸钠溶液、铁标准溶液、四氯化碳、缓冲溶液、硫代硫酸钠溶液。

3.1.3仪器试管、移液管（1mL 、2mL 、5mL 10mL 、20mL ）、l0mL 容量瓶、烧杯、表面皿、250mL 锥形瓶、1000mL 棕色试剂瓶、10mL 具塞比色管×8和比色管架、试管、试管架、50mL 离心管×2、容量瓶（100mL 、250mL 若干）、烧杯（150mL 、250mL 若干）分析天平（内置2个称量瓶）、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、酸度计、精密pH 试纸（可测pH4.7）、电炉、温度计、水浴箱。

3.2牛奶中酪蛋白的提取 3.2.1酪蛋白的粗提50mL 鲜牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液（40mL 左右），用精密pH 试纸或酸度计调pH 至4.7。

（pH 调不好，出不来沉淀）将上述悬浮液冷却至室温。

（7楼734）离心15分钟（3000 r·min -1）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

3.2.2酪蛋白的纯化用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min -1），弃去上清液。

在沉淀中加入30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀2次，抽干（抽滤困难）。

将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3.2.3准确称重，计算含量和得率含量：酪蛋白g/(100 mL)牛乳%100⨯=真实含量提取得到的含量得率3.3酪蛋白含量的测定3.3.1标准曲线的绘制与样品的测定取试管8支，按下表操作。

表1 酪蛋白含量的测定各管混匀、放置37℃水浴中保温20min 。

540nm 比色，以空白管(1号管)调零点，读取各管吸光度值。

3.3.2计算在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g·L -1)，并求出牛奶中蛋白质浓度。

由此浓度计算出100mL 鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

3.4钙含量的测定3.4.1 EDTA 溶液浓度的标定准确移取20.00mL CaCO 3标准溶液3份分别于250mL 锥形瓶中，加入2mL NaOH 溶液，铬蓝黑R 指示剂3~4滴（视指示剂的有效浓度而定），用EDTA 溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用去EDTA 毫升数和CaCO 3标准溶液的浓度，计算EDTA 溶液的浓度。

1 2 3 4 5 6 测定管1 测定管2蛋白质标准液(mL) － 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 － －待测蛋白样品(mL) － － － － － － 2.00 2.00 0.9%NaCl(mL) 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 - － － 双缩脲试剂(mL) 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 吸光度A 蛋白质浓度（g/100mL ）表1 EDTA浓度的标定3.4.2钙制剂钙含量的测定准确移取50.00ml（20.00ml，仪器里面最大是20.00ml移液管）的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH 4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R3~4滴，用0.01mol·L-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑R，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（mg/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。

（消耗约25 ml EDTA）表2 钙含量的测定3.4.3 注意事项量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 mol·L -1EDTA 体积为20~30 mL 。

由于牛奶、钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

4.实验结果4.1 酪蛋白含量的测定表1 酪蛋白含量的测定图1 酪蛋白含量的测定1 2 3 4 5 6 牛奶管 酪蛋白管蛋白质标准液(mL) －0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 － －待测蛋白样品(mL) －－ － － － － 2.00 2.00 0.9%NaCl(mL) 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 - － － 双缩脲试剂(mL)8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 吸光度A 0.000 0.098 0.179 0.266 0.366 0.457 0.153 0.284 蛋白质浓度（g/100mL ） 0.0000.0400.0800.1200.1600.2000.0670.1244.2钙含量的测定表1 EDTA浓度的标定表2 钙含量的测定5.分析讨论5.1了解蛋白质及钙、铁、锌等微量元素与人体健康的关系答：（1）蛋白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。

他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存。

蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。

蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。

人体中估计有10万种以上的蛋白质。

生命是物质运动的高级形式，这种运动方式是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质有极其重要的生物学意义。