存档编号赣南师范学院学士学位论文从脐橙渣中提取类柠檬苦素的工艺研究教学学院化学与生命科学学院届别 2011专业生物科学学号 070907029姓名孙禹晗指导老师吴笑臣完成日期 2010-5-13目录摘要 (2)关键词 (2)Abstract (2)Keywords (3)1前言 (4)1.1 研究的背景与意义 (4)1.2 脐橙中的柠檬苦素类化合物 (4)1.3柠檬苦素类似物提取方法研究进展 (5)1.4选题意义、目的和研究内容 (6)2实验部分 (7)2.1材料与试剂 (7)2.2实验方法 (7)3结果分析 (10)3.1Plackett-Burman实验 (10)3.2最陡爬坡实验 (12)3.3响应面优化实验 (12)3.4柠檬苦素类似物提取最佳条件的确定与验证 (19)4结论 (19)参考文献 (20)致谢 (22)从脐橙渣中提取类柠檬苦素的工艺研究摘要：以赣南脐橙渣为原料，以乙醇为提取溶剂。
利用Design Expert软件、采用Plackett-Burman(PB)实验设计和响应面分析法，对脐橙渣中柠檬苦素类似物的提取条件进行了优化研究，选取乙醇浓度、超声时间、浸提温度为响应变量，以柠檬苦素类似物得率为响应值，利用Box-Behnken试验设计方案和响应面分析法，建立了柠檬苦素类似物得率与响应变量的回归方程，并确定最佳提取条件为乙醇浓度82%、超声时间18min、浸提温度60℃此条件下柠檬苦素类似物得率为1.630‰，与预测值1.651‰较为一致。
关键词：脐橙渣柠檬苦素类化合物提取响应面分析法优化Study on Extraction of Limonoids from NavelOrange ResidueAbstract:Navel orange residue was used to extract limonoids with ethanol.The extraction parameters including ethanol concentration , time of ultrasonic and temperature of lixiviate were optimized using Box-Behnken design and response surface methodology based on Plackett - Burman (PB) design of experiment for achieving maximum yield of limonoids. A regression equation reflecting the relationship between the yield of limonoids and the above extraction parameters was set up.The optimal extraction parameters were found as follows: ethanol concentration82%; time ofultrasonic 18min; temperature of lixiviate 60℃.Under the optimized conditions, the actual yield of limonoids was1.630‰, close to the predicted value of 1.651‰.Keywords: navel orangeresidue; limonoids; extraction; response surface methodology; optimization1前言1.1研究的背景与意义脐橙是赣南地方经济发展的重要支柱产业，也是果农的主要经济来源，得到了国家、省、市各级政府的大力支持。
近年来，随着赣南脐橙种植面积的增大、榨汁加工业的快速发展，每年都会产生大量的脐橙渣。
这些残渣中含有许多重要的生物活性物质，如类柠檬苦素、黄酮类化合物、香精油等。
目前国内柑橘加工后的皮渣一般作为饲料、肥料或废弃物处理，利用率及经济效益低，且易污染环境。
研究表明，柠檬苦素及其类似物在抗肿瘤、镇痛、抗炎、改善睡眠、抗病毒、抗菌、利尿、抗焦虑[1]，调节胆固醇含量、防止动脉粥样硬化和除虫等方面都具有显著效果[2-3]，它还是一种新型的食品添加剂，市场价格昂贵（进口价至少在2500元/50mg以上），而且国内生产极少，市场潜力很大。
目前美国、日本已出现柠檬苦素类似物制作药物、功能性食品和饮料的专利[4-5]。
因此，充分开发脐橙渣资源，提取其中的活性物质，最大限度地提高脐橙产业的科技含量和产品附加值是十分必要的，这对减少环境污染、发展地方经济等都具有非常重要的意义。
1.2脐橙中的柠檬苦素类化合物柠檬苦素类物质（limonoids）是一种三萜类的植物次生代谢产物[6]，主要存于芸香科植物和楝科植物中，现今已分离得300多种柠檬苦素类化合物，柑橘属中分离出36种柠檬苦素类物质和19种配糖体[7-9]，主要有柠檬苦素(limonin)、诺米林(nomilin)、柠檬苦素A一环内酯(limonoate A-ring Lacton)、柠檬苦素17-β-D吡喃葡萄糖苷(limonin17-β-D-glucopyranoside)、宜昌素(ichangin)和诺米林酸(nominic acid)等物质[10]。
部分柠檬苦素类化合物的分子结构如图1。
图1 部分柠檬苦素类化合物的结构式1.3柠檬苦素类似物提取方法的研究进展[11]随着对柑橘柠檬苦素类似物生理活性的阐明，对柠檬苦素类化合物的提取分离以及作为功能性食品添加剂的应用已经开始，柠檬苦素类似物的提取方法主要有有机溶剂提取法、水—醇浸提法以及微波或超声波、涡流振荡提取。
有机溶剂浸提法：有机溶剂提取法是目前国内外使用最广泛的方法，易用于生产。
首先是脱脂，使用石油醚、乙醚或正己烷进行脱脂；第二步是浸提或萃取，常用萃取剂有：三氯甲烷、二氯甲烷、己烷、正己烷、丙酮等进行提取4—12h，将所得提取液过滤并浓缩至干得到粗产品为柠檬苦素类似物。
水—醇浸提法：由于柠檬苦素类似物水溶性较差，所以采用有机溶剂提取较多，但丙酮、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂具有一定的毒副作用，而且最终产品较难去除干净，易残留于产品中。
为此可采用水—乙醇作为萃取剂进行提取，具有无毒、安全性高、易回收利用等特点。
主要采用水醇浸提、酸醇浸提。
微波或超声波、涡流振荡提取：利用微波或超声波、涡流振荡处理产生的激流、乳化、扩散、击碎、振荡等综合效应，可加速柠檬苦素类似物从组织中转移、扩散到溶剂中，从而提高柠檬苦素的浸出效率和产品纯度。
1.4选题意义、目的和研究内容在已有的类柠檬苦素提取方法中，或是采用丙酮、氯仿等毒性较强的有机溶剂, 造成有机溶剂残留严重，或是设备一次性投资大。
因此，寻找绿色环保的提取剂，研究高效的提取工艺是制取脐橙类柠檬苦素的关键，对提高赣南脐橙产品经济效益和科技附加值具有重要的意义。
本工作拟用脐橙渣质为原料，以乙醇为溶剂，超声波辅助提取类柠檬苦素，研究最佳工艺条件，其研究内容有：（1）Plackett-Burman实验设计法：一种两水平的实验设计方法，其基于非完全平衡块原理，可以用最少实验次数估计出因素的主效应，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用。
（2）最陡爬坡实验：以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速地逼近最佳区域。
（3）响应面分析法：利用响应面分析法中的Box-Behnken实验方案进行实验，对实验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优实验条件，并进行验证。
2实验部分2.1材料与试剂2.1.1实验原料新鲜脐橙榨汁后剩余皮渣，由江西省脐橙工程技术研究中心提供。
2.1.2主要试剂石油醚分析纯天津市大茂化学试剂厂无水乙醇分析纯天津市大茂化学试剂厂95%乙醇分析纯天津市大茂化学试剂厂浓硫酸化学纯江西洪都生物化学有限公司对-二甲氨基苯甲醛分析纯天津市天新精细化工开发中心柠檬苦素进口2.1.3主要仪器DZF-6090型真空干燥箱上海三发科学仪器有限公司KQ-600B型超声波清洗器昆山市仪器有限公司HH-2型数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂WFJ 7200分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司电子天平；榨汁机。
2.2实验方法2.2.1试剂的配制[7](1)柠檬苦素标准液：用电子天平准确称取0.0092g柠檬苦素，用适量蒸馏水溶解，待溶解后转移至50mL容量瓶中，定容，摇匀，制得质量浓度为184mg/L的柠檬苦素标准溶液。
(2)显示剂：量取65mL 浓硫酸和35mL 无水乙醇，将其混合，待冷却后加入125mg 对-二甲氨基苯甲醛。
使用时再向该溶液中加入9%的三氯化铁溶液0.05mL 并混匀，现用现配。
(3)9%三氯化铁溶液:称取 4.5g 三氯化铁固体，将固体溶于45.5mL 蒸馏水中，待冷却转移至棕色试剂瓶中保存。
2.2.2 制作标准曲线取6支试管，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6和2mL 上述柠檬苦素标准溶液，并以无水乙醇稀释至2mL ，再分别加入5mL 显色试剂，以柠檬苦素空白液为参比，显色30min 后在550nm 处测定其吸光度。
以吸光度A 对柠檬苦素的质量浓度作图，得出柠檬苦素的标准曲线，见图2。
回归方程为y=0.0024x+0.0007，线性相关系数为0.9994。
图2柠檬苦素比色测定标准曲线 2.2.3实验步骤将湿脐橙渣晾晒后过40目筛，取干燥脐橙渣于索氏提取器中用石油醚（60℃～90℃）回流脱脂24h ，干燥备用。
准确称取5g 样品，在不同的影响因素下按相应的液料比加入乙醇溶液，超声一定时间后放入水浴锅中浸提，一定时间后进行抽滤，将滤液用吸光值旋转蒸发器蒸干得浸膏，用少量二氯甲烷溶解浸膏，再抽滤，将滤液旋转蒸干，加10mL 无水乙醇溶解，得柠檬苦素类似物提取液。
以2.2.2节方法测其吸光度，计算得率。
2.2.4柠檬苦素的定量分析方法式中：c 为提取液中柠檬苦素类似物质量浓度（ug/mL ）；V 为提取液体积（mL ）；m 为脐橙渣的质量(g)。
2.2.5 Plackett-Burman 实验Plackett-Burman 建立在不完全平衡板块原理的基础上，通过 N 个实验至多可以研究(N －1)个变量(N 一般为 4的倍数)。
在实验过程中，通常会预留出虚拟变量作为误差分析[12]。
每个变量有高、低两个水平，分别以+1、-1 标记，各因素水平设置见表 1。