柑桔柠檬苦素类化合物的研究：一个综述 摘要：柑橘中柠檬苦素类似物是一种罕见的天然化合物。现已深入研究了其生物化学性质，生物功能，在食品中的应用，在植物生理学中的重要性，在不同植物物种和栽培品种的关系，副产品回收，和商业应用。柠檬苦素类似物作为在食品中存在的潜在预防癌症的化合物，有着很大的意义。本章总结了前人对柑橘中柠檬苦素类似物的化学和生物化学研究，以及探讨了以柠檬苦素类似物在人类和植物健康中发挥着的作用为研究方向的进一步研究项目。 柑橘类水果是世界上最受欢迎的食品之一，每年全球农业产量超过1亿吨。作为一种被消耗的新鲜水果，柑橘的数量十分可观，越来越多的消耗来自于柑橘的加工产品，比如果汁、浓缩果汁、柑橘类饮料、其他食品等，都会消耗很多的水果。除了是一种受喜欢的水果外，柑橘类水果已被证明具有许多对人体健康有重要影响的成分：维生素C、类胡萝卜素、叶酸、黄酮类化合物、类柠檬苦素、钾、优质水溶性纤维等等。然而，在处理柑橘产品中有一个长期存在的问题，即苦味，尤其是橙汁和柚子汁中苦味更为明显。在不同的栽培品种中苦的程度各不相同。果汁中存在的苦味使其有着较低的市场价值，有时用吸附树脂处理，与其他无苦味的果汁混合，或丢弃。在柑橘类果汁中苦味是由两种化合物导致：二氢黄酮新橙皮，如在柚子相关品种中发现的柚皮苷，和类柠檬苦素（1,2）。 柠檬苦素类似物是于芸香科、楝科家族的植物中出现的高含氧的三萜化合物。柠檬苦素作为这组植物化学物质中的第一大化合物，从1841年以来已经被认为是柑橘的组成部分（3）。1938年从脐橙果汁中得到分离（4），并在1949年（5）证明了脐橙果汁中的苦味原理。柠檬苦素结构却是在发现该种物质的120年后才发现。其结构是通过组合化学的方法和X-射线晶体学在20世纪60年代确定（6，7）。柠檬苦素的化学成分是C26H30O8，分子质量是470。 柠檬苦素类化合物是柑桔类水果中已被证明具有生物活性的重要的质量成分。一个柠檬苦素苷元在植物中作为病虫害抑制物发挥着作用。当需要保护的组织受病原体攻击时它们在新叶和果实中都是丰富的（8）。 由Guadagni等人进行的关于柠檬苦素味阈值的一个综合性研究（9，10）。他们发现仔细筛选（苦味）的鉴定人一致能够在较低的水平中检测出柠檬苦素。约30%的鉴定人能够在含柠檬苦素2 ppm的果汁中品尝出苦味。75%能在6 ppm的柠檬苦素果汁中品尝出苦味，这也被认定为是味觉阈值。柠檬苦素在早熟柑橘中尤为严重，比如脐橙。脐橙果汁从早期到中期的中能够获得差不多25ppm的柠檬苦素（11）。葡萄柚中柠檬苦素的含量也十分显著，在早期平均水平可达到15 ppm以上（11）。 近几年，在对柠檬苦素的化学和生物化学研究中取得了重大进步，也提供了一些关于柠檬苦素的新的信息。通过遗传工程来解决柑橘果汁中柠檬苦素苦味问题也取得了进步。同时，柠檬苦素类化合物也被证明在人类饮食中是重要的化合物。 柠檬苦素的分析应用 德雷尔（12）在柠檬苦素类化合物分析领域取得了几个重大贡献，包括对柠檬苦素进行检测的薄层色谱分析和通过核磁共振（NMR）来确定柠檬苦素类化合物结构。长谷川和班尼特利用这两种方法进行分离和鉴定出30多个柠檬苦素糖苷配基和柑橘及其近缘种中的20种柠檬苦素苷。 对柠檬苦素类化合物的检测和定量分析的重要分析技术是由Fisher提出的高效液相色谱法（13）、曼塞尔和维勒提出的放射性免疫测定（14），和Manners 和 Hasegawa最近提出的质谱法（15）。大多数这些方法（除了RIA(放射性免疫测定)）需要使用有机溶剂萃取，分区和固相萃取的样品制备。高效液相色谱法通过其准确性和可重复性已成为最广泛使用的方法。正相和反相的方法已被用于等度和梯度的研究方法（16）。 柑橘汁中的延迟苦味 通常来说，如果只食用新鲜的脐橙或者是挤压的果汁并立刻消耗掉，是感觉不到脐橙的苦味的。然而，果汁榨汁后如果在室温下放置或隔夜储存在冰箱里几个小时就会变苦。这种逐渐增加的痛苦，或延迟苦味，在脐橙橙汁中是由从无味前体中形成的柠檬苦素造成的。这种延迟苦味区别于发生在和蜜柚相关品种的黄烷酮新橙皮糖苷和柠檬苦素的苦味。由于一定条件下产生的柠檬苦素，许多其他的冬季柑橘也可能产生苦味的果汁。在柑橘和柑橘杂交种中分离出来了36种柠檬苦素糖苷配基，其中只有6种是苦的（17）。柠檬苦素在大多数柑橘类果汁中是主要的类柠檬苦素，也是造成延迟苦味的主要原因。诺米林也包括其中，但它的作用很小（18）。其他的类柠檬苦素化合物在商业柑橘类果汁中的浓度存在并不显著。 直到1968，延迟苦味的机制尚未完全理解。最初形成的理论由Higby首次提出，他首次从华盛顿脐橙的橙汁中分离出柠檬苦素（4）。多年来对前期理论支持的证据也得到积累。迈耶和贝弗利（1）最终确定柠檬苦素单内酯为柑橘果实中柠檬苦素的前体。一环闭合反应在酸性条件下，pH值低于6.5，并被酶（柠檬苦素D—环内酯水解酶）催化（19）。延迟苦味在柑橘果汁生产中是一个重要的经济问题。它降低了商品果汁的质量和价值，对柑橘产业有着显著的负面经济影响。异常的天气和收获条件是造成水果组织破坏的原因，如冷冻或机械收获损坏，可促进果实中的酸性pH，以及促进柠檬苦素中Α-环内酯制造苦味。 不管是具有苦味的类柠檬苦素还是无苦味的类柠檬苦素，其结构都显示出检测口中苦味的一些结构要求（17）。一些其他的甜和苦的化合物可以改变检测柠檬苦素的苦味的界限（17）。 β-D-呋喃果糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷是柠檬苦素的弱化抑制。其他甜味剂如新橙皮苷二氢查尔酮、橙皮甙二氢查尔酮，和天冬氨酰—苯丙氨酸甲酯也作为抑制剂。柠檬酸在柠檬苦素苦味检测中发现有着明显的抑制作用。柚皮苷，在柑橘中类黄酮苦味的原理，已被证明是一个苦味检测阈值的抑制物。 柠檬苦素类化合物的生物合成 由Hasegawa等人在放射性示踪器的基础上，提出了柠檬苦素类化合物的生物合成途径（20）。柑橘苗已被用来准备14 C标记的醋酸甲羟戊酸诺米林标记（21）。诺米林最有可能是从柑橘及其杂交种中分离出的所有其他类柠檬苦素的前体。诺米林是在韧皮部的茎组织中生物合成，通过萜类化合物的合成途径，从醋酸甲羟戊酸到法尼基焦磷酸（22）。然后是进入茎叶、果实中，果皮和种子，它是进一步在各组织代谢的过程中使其他类柠檬苦素至少通过四个不同的通路：柠檬苦素通路、卡拉敏通路、宜昌根辛通路、以及7-醋酸柠檬苦素途径（23，24）。 在柑橘中有五类酶的参与柠檬苦素的生物合成和其生物降解（24）。一类是只存在于柑橘茎组织的韧皮部区域是生成诺米林的特异酶。第二类酶在柑橘的所有组织中存在，包括叶，茎，果汁囊瓣，果皮和种子，主要是将诺米林转化成其它种类柠檬苦素糖苷配基。柠檬苦素D环内酯水解酶的活性多发生于种子，即其催化D-环内酯化。在果实生长过程中，新合成的单内酯通过这种酶来转换。 UDP-D-葡萄糖：柠檬苦素葡糖基转移酶，在果实组织和种子中出现，其作用是在成熟过程中催化柠檬苦素苷元到各自的糖苷的转化。柠檬苦素β糖苷酶的活性是在种子萌发过程中催化柠檬苦素糖苷配基释放苷元和葡萄糖，只发生在种子。 柠檬苦素类似物的糖基化：一个自然脱苦过程 柠檬苦素苦味是在季节初期至中期的冬季水果中的一个问题，但不是在晚季水果。随着果实成熟，柠檬苦素Α环内酯浓度降低（25）。一个多世纪以来，这种自然脱苦过程都被认识到，但其机理直到柑橘组织柠檬苦素糖苷的发现才被认识到。 1989年，长谷川等人（26）在柑橘中发现柠檬苦素苷的存在，并在果实生长后期果实组织和种子成熟过程中确定了柠檬苦素苷元转化为其各自苷元的过程。（25）之后，20种柠檬苦素糖苷在柑橘和其杂交种中被分离（24）。这些化合物都含有一个D-葡萄糖分子通过β糖苷键连接到一个相应的糖苷配基。在这个位置中的葡萄糖基团的存在可以防止形成闭合的D型环，也是苦味感觉所要求的一个关键结构。 在加州种植的脐橙和巴伦西亚橙的糖基苷从九月开始，一直持续到水果收获（25，27）。从初期到中期收获的脐橙果汁开始延迟苦味，而来自瓦伦西亚橙的果汁则没有。不同之处在于在脐橙的短成熟时期，在十一月成熟期的前两个月。在这短短的时间内，没有足够的糖苷配基转换。在另一方面，在三月成熟期之前，巴伦西亚橙有至少六个月成熟季节。在这额外4个月成熟的过程中，柠檬苦素糖苷配基几乎完全转化为无味苷。 负责这种转化的酶已被鉴定出，命名为UDP-U-葡萄糖：柠檬苦素葡萄糖基转移酶（28）。柠檬苦素糖苷配基只有在成熟的果实组织和种子中才能发现，而不是在未成熟的果实组织和种子中，也没有在叶和茎中发现。一般甜橙有比较高水平的柠檬苦素葡萄糖基转移酶活性，因此，它们含有高浓度的柠檬苦素糖苷配基。相比之下，柚中这种酶的活性很低，所以其果汁中即使在很晚的季节也有低水平的柠檬苦素糖苷配基和高水平的苦柠檬苦素苷元。在加州成熟的柚子汁中，平均含有18 ppm的柠檬苦素和29 ppm的总柠檬苦素糖苷配基（29）。柚杂交品种如葡萄柚，Oroblanco和酸橙也具有相对低浓度的柠檬苦素糖苷配基，这表明具有活性的柠檬苦素葡萄糖基转移酶在这些栽培品种中也非常低（30）。 柠檬苦素中17β-D-吡喃葡萄糖苷β葡萄糖苷酶催化的柠檬苦素糖苷水解并释放柠檬苦素和葡萄糖。这种酶是参与柠檬苦素生物降解和只存在于休眠成熟种子和发芽种子中（31）。存储在果实组织的柠檬苦素糖苷是非常稳定的。然而，在种子发芽过程中，糖苷水解解放葡萄糖和柠檬苦素苷元。在萌发过程中，类柠檬苦素有可能作为杀虫剂发挥作用，而葡萄糖将在一般代谢中发挥作用。商业果汁加工过程中，破碎的种子可能释放β葡糖苷酶的活性在果汁中。这可能会增加苦柠檬苦素苷元的水平，如如柠檬苦素，水解无味柠檬苦素苷。 商业果汁脱苦方法 许多种使柑橘汁中脱苦的方法都是（32，33）利用吸附剂和离子交换树脂。虽然这些方法都有效地从极度苦的果汁中完成脱苦，但它们的商业市场有限。果汁中苦味是由真正的类柠檬苦素界定的，每种方法都有它的缺点。当然，这些脱苦方法都不会在全部水果中使用。目前，最广泛使用的脱苦方法是融合苦汁与非苦汁，来稀释苦味。 一个比较好的解决这个问题的方法是通过遗传工程来生产出新的柑橘品种。创建转基因柑橘植物的方法早已深入人心。通过适当的遗传物质插入，它可能是创造出不生产柠檬苦素的水果。我们广泛的新陈代谢研究已经表明，插入的三个基因中的一个基因编码特定柠檬苦素代谢酶，可以使在转基因植物中收获无苦味水果。这些酶中已有