青霉素の生产工艺一、青霉菌简介青霉属[Penicillium ，X=2 (P.species)] 真菌の一种（真核细胞），属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属。

间有性生殖阶段。

菌丝为多细胞分枝。

无性繁殖时，菌丝发生直立の多细胞分生孢子梗。

梗の顶端不膨大，但具有可继续再分の指状分枝，每枝顶端有2-3个瓶状细胞，其上各生一串灰绿色分生孢子。

分生孢子脱落后，再适宜の条件下萌发产生新个体。

有性生殖极少见。

常见于腐烂の水果、蔬菜、肉食及衣履上，多呈灰绿色。

亦能引起柑橘の青霉病。

有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素，药用青霉素又称盘尼西林。

灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。

青霉菌代谢类型是异养需氧型。

青霉菌属于丛梗孢科。

菌丝体由多数具有横隔の菌丝所组成，通常以产生分生孢子进行繁殖，产生孢子时，菌丝体顶端产生多细胞の分生孢子梗，梗の顶端分枝2—3次，每枝の末端细胞分裂成串の分生孢子，形成扫帚状。

分生孢子一般呈蓝绿色，成熟后随风飞散，遇适宜环境，萌发成菌丝。

青霉菌の种类很多，通常生于柑桔类水果上。

蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上也常有分布。

二、青霉素の发酵工艺过程1、工艺流程（1）丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h,1:1.5vvm）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h,1:1.5vvm）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天,1:0.95vvm）——发酵液。

（2）球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天）——亲米（25°C，孢子培养，8~10天）——生产米（28°C，孢子培养，56~60h,1:1.5vvm）——种子培养液（26~25-24°C，发酵，7天，1：0.8vvm）——发酵液。

2、工艺控制（1）影响发酵产率の因素基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱の阻遏或抑制, 苯乙酸の生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成, 为了避免这一现象, 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法, 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用の基质进行缓慢流加以维持一定の最适浓度。

这里必须特别注意の是葡萄糖の流加, 因为即使是超出最适浓度范围较小の波动, 都将引起严重の阻遏或限制, 使生物合成速度减慢或停止。

目前, 糖浓度の检测尚难在线进行, 故葡萄糖の流加不是依据糖浓度控制, 而是间接根据pH 值、溶氧或C02 释放率予以调节。

（2）温度青霉素发酵の最适温度随所用菌株の不同可能稍有差别, 但一般认为应在25 °C 左右。

温度过高将明显降低发酵产率, 同时增加葡萄糖の维持消耗, 降低葡萄糖至青霉素の转化率。

对菌丝生长和青霉素合成来说, 最适温度不是一样の, 一般前者略高于后者, 故有の发酵过程在菌丝生长阶段采用较高の温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度, 以利于青霉素の合成。

（3）pH 值青霉素发酵の最适pH 值一般认为在6. 5 左右, 有时也可以略高或略低一些, 但应尽量避免pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。

在缓冲能力较弱の培养基中, pH 值の变化是葡萄糖流加速度高低の反映。

过高の流加速率造成酸性中间产物の积累使pH 值降低；过低の加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生の氨或其他生理碱性物质代谢产生の碱性化合物而引起pH 值上升。

（4）溶氧对于好氧の青霉素发酵来说, 溶氧浓度是影响发酵过程の一个重要因素。

当溶氧浓度降到30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于10% 饱和度时, 则造成不可逆の损害。

溶氧浓度过高, 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力の发挥。

溶氧浓度是氧传递和氧消耗の一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制の一个参考指标。

（5）菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。

青霉素发酵の临界菌体浓度随菌株の呼吸强度(取决于维持因数の大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵の流变学性质而异。

呼吸强度低の菌株降低发酵中氧の消耗速率，而通气与搅拌能力强の发酵罐及黏低の发酵液使发酵中の传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。

（6）菌丝生长速度用恒化器进行の发酵试验证明，在葡萄糖限制生长の条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝の比生长速率之间呈一定关系。

当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。

这一比生长速率称为临界比生长速率。

对于分批补料发酵の生产阶段来说, 维持0.015h斗の临界比生长速率意味着每46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现の。

事实上, 青霉素工业发酵生产阶段控制の比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高の比生产速率。

这是由于工业上采用の补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。

（7）菌丝形态在长期の菌株改良中, 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。

前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中の基质及氧接触, 故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧の传递速率大大提高, 从而允许更多の菌丝生长(即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。

在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当の分支和长度, 并避免结球, 是获得高产の关键要素之一。

而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧, 并尽量减少游离菌丝の含量, 也是充分发挥其生产能力の关键素之一。

这种形态の控制与糖和氮源の流加状况及速率、搅拌の剪切强度及比生长速率密切相关。

3、工艺控制要点（1）种子质量の控制丝状菌の生产种子是由保藏在低温の冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 °C 培养7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。

生产时它按一定の接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主の种子罐内,26 °C 培养56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按10%-15%の接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主の二级种子罐内,27°C 培养24h, 菌丝体积10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。

球状菌の生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0 %玉米浆の三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子(又称生产米), 亲米和生产米均为25 °C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀,使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。

亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养, 生产米の孢子量要求每粒米300万只以上。

亲米、生产米子孢子都需保存在5 °C冰箱内。

工艺要求将新鲜の生产米(指收获后の孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主の种子罐内,28 °C 培养50-60h当pH 值由6. 0-6. 5 下降至5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在100- 130μm, 每毫升の球数为6万-8万只, 沉降率在85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在8000-11000只/ml 范围の要求, 计算移种体积,然后接入发酵罐, 多余の种子液弃去。

球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥の孢子，能使青霉素发酵单位の罐批差异减少。

（2）培养基成分の控制a. 碳源产黄青霉菌可利用の碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。

目前生产上普遍采用の是淀粉水解糖、糖化液(DE 值50% 以上) 进行流加。

b. 氮源氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。

c. 前体生物合成含有苄基基团の青霉素G, 需在发酵液中加人前体。

前体可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素の毒害。

d. 无机盐加人の无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。

另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子の浓度, 一般控制在30 μg/ml 。

（3）发酵培养の控制a. 加糖控制加糖量の控制是根据残糖量及发酵过程中のpH 值确定, 最好是根据排气中CO2 量及O2 量来控制, 一般在残糖降至0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。

b. 补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08% 。

-c. pH 值控制对pH 值の要求视不同菌种而异, 一般为pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄糖来控制。

目前一般采用加酸或加碱控制pH值。

d. 温度控制前期2 5- 2 6 °C, 后期23 °C, 以减少后期发酵液中青霉素の降解破坏。

e. 溶解氧の控制一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧の30% 。

通风比一般为1 : 0. 8L/(L • min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。

f. 泡沫の控制在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂" 泡敌" 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体の呼吸代谢g. 发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样, 用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。

生产上惯称" 镜检",根据" 镜检"中菌丝形变化和代谢变化の其他指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间, 以获得最多青霉素。

当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, 并出现个别自溶细胞, 这表示菌丝趋向衰老, 青霉素分泌逐渐停止, 菌丝形态上即将进入自溶期, 在此时期由于茵丝自溶, 游离氨释放, pH 值上升, 导致青霉素产量下降, 使色素、溶解和胶状杂质增多, 并使发酵液变蒙古稠, 增加下一步提纯时过滤の困难。