光激化学发光免疫检测技术与临床应用研究进展高云朝近半个世纪以来，临床化学微量免疫分析技术从放射免疫分析、酶联免疫分析，到化学发光免疫分析，经历了检测方法的革新与技术的进步，医学检验质量和数量得到了迅速的提高；20世纪90年代问世的LOCI(Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技术以其独特的检测方法，实现了均相、一步、免清洗和高通量的检测，并以其高灵敏度和特异性等突出的检测性能为世人所瞩目。

该技术最初由Ullman等[1]在1994年报道，由美国德灵公司研发成功，后由PerkinElmer公司生产相关试剂(AlphaScreen TM)，西门子公司生产免疫诊断试剂（LOCI）。

国产光激化学发光免疫检测系统由博阳生物科技（上海）有限公司建立在该技术之上，并称之为LiCA（Light Initiated Chemiluminesence Assay，LiCA TM）。

仅此对该技术基本原理和特点，以及目前国内外研究现状综述如下。

一、技术原理和特点1．LOCI检测原理：基于非竞争的免疫检测方法类似于ELISA，而基于的竞争的免疫检测方法类似于放射免疫分析法。

以前者为例，双抗体夹心结构(抗体包被发光珠-抗原-生物素化抗体)与链霉亲和素包被的感光珠，通过链霉亲和素与生物素结合到一起，并拉近发光珠和感光珠的间距。

然后，感光珠在680nm激发光的照射下，使周围氧分子激发变成单线态氧(1△g O2，带有1个激发态电子的氧分子)，后者扩散至发光珠并传递能量，发光珠发射520-620 nm荧光信号并被光子计数器探测。

此过程中，单线态氧的半衰期只有4μs，且最大扩散距离大约200nm。

而一般而言，当体系中不存在抗原抗体复合物时，发光珠和感光珠之间的距离大于200nm。

因此，此三级发光系统只有结合态发光珠才能传递单线态氧的能量并发光；非结合态发光珠由于相距较远，无法获得能量而不发光[1-6](图1)。

注：光激化学发光检测时，a 图为感光珠和发光珠结合时则发光，b 图为感光珠和发光珠不结合则不发光图1 光激化学发光检测感光珠和发光珠的原理示意图2．技术特点：光激化学发光技术的特点是基于偶联在供体-受体微球表面的发光物质经光激发和能量传递而诱导发光，能量传递依赖于受体-配体结合所致的供体-受体微球相互靠近而实现，而常见的受体-配体系统如抗原-抗体、生物素-亲和素、蛋白酶-底物。

其采用纳米级微粒作为固相载体，增加了反应的比表面积，极大地提高了检测灵敏度和缩短了反应时间；恰当的荧光波长及时间分辨计数模式，有效提高了信噪比，增加了特异性[1-2]；均相反应模式实现了一步、免清洗检测。

检测过程不易受到荧光淬灭、样本常见干扰物质、pH值、离子强度及温度等因素的影响，保证了检测的稳定性[7-9]。

样本用量少(一般2.5μl)，易于实现机器的小型化和样本的高通量检测[10]，且有利于基于小动物的基础研究[7]。

二、国内外研究现状和应用光激化学发光技术应用广泛，涵盖蛋白质、多肽激素、核苷酸等领域，在受体／配体、蛋白质／蛋白质、蛋白质／DNA之间相互作用方面的研究成果，对发病机制的研究和新药研发具有重要指导意义。

(一)小分子半抗原1．地高辛：临床检验急症项目要求准确而快速的结果回报(TAT)，。

目前，全自动化学发光法的反应时间一般为18 min；LOCI法通常只需要5 min，甚至可以缩短至l min，且不明显影响其检测性能，有效检测范围为0.5-5μg／L[2]。

2．环孢霉素A(CsA)：CsA是接受器官移植时通常采用的免疫抑制剂，其在不同个体的生物利用率和药代动力学不同，不同个体对其敏感性和耐受性也存在较大差异。

因此，血药浓度检测及药代动力学研究，对器官移植的成败非常重要。

传统方法(高压液相、放免分析等)一般在全血样本溶解后，需要离心去除细胞碎片；LOCI方法可直接在上述混合溶液中进行，由此简化了操作步骤，减少了实验误差，其有效检测范围为0-750μg／L[2]。

3．其他：如茶碱、雌二醇、游离甲状腺素、叶酸等，都可以采用光激化学发光法检测。

与传统分析方法相较，具有反应时间短、样本用量少、免洗、高通量等优点[1-2]。

(二)抗原分子1．促甲状腺素(TSH)：在甲状腺功能评价中，TSH检测范围为0.01-300 mU／L，对于甲状腺机能减低(TSH升高)或甲状腺机能亢进(TSH降低)的诊断和疗效评价具有重要意义。

LOCI检测TSH的灵敏度达0.002 mU／L，优于化学发光法的0.01 mU／L，这对于亚临床甲状腺机能亢进的诊断与治疗更为有利。

此外，当反应时间由14 min缩短至2 min以内时，灵敏度仍然可达0.007 mU／L，完全满足临床诊治需要，同时，极大地提高检测效率，有效缩短TAT时间。

通过对20例垂体切除后患者血清TSH(期望值为0)检测表明，其平均浓度与0 mU／L差异无统计学意义。

为适应高通量和小型化芯片技术，Dafforn等[10]将样本用量由常规的80μl(一般免疫分析方法用量为100-200μl)减少至l0μl，虽然检测灵敏度出现轻度下降，但仍可满足临床要求。

2．绒毛膜促性腺激素(hCG)：孕妇血清或后穹隆穿刺液中hCG浓度常常高于目前绝大多数免疫分析方法的检测上限(1000 U／L)，需要稀释后重新检测，有时甚至需要多次稀释，这既浪费了时间，又增加了成本。

Ullman等[2]用LOCI技术检测hCG的上限达100000 U／L，使绝大多数样本1次检测即可获得准确结果；而且，与常规免疫检测方法比较，样本用量更少(10μl)、检测时间更短(7.5 min)，这对于穿刺液量少和急诊患者极为有利。

3．胰岛素：胰岛素既是一种药物，也是评价胰岛B细胞功能的生物标志物，其浓度检测对于糖尿病的发病机制研究、分型、疗效检测等具有重要价值。

特别在药代动力学和药效学研究领域．快速、高通量、微量样本检测技术无疑是非常重要的，而大批量小动物实验研究尤其如此。

Poulsen和Jensen [7]应用LOCI检测技术在384孔板上测定人血浆胰岛素，样本用量仅5μl，分析灵敏度为0.3 pmol/L，功能灵敏度为1.0 pmol/L，最高浓度可以达到10000 pmol/L。

同时具有较高的批内(1.9％-3.8％)和批间(4.6％-7.3％)精密度；中度溶血、黄疸、脂血、生物素、维生素C对检测无明显影响(严重溶血时，回收率降低到73％)；与酶免分析方法具有很好的相关性。

4．β淀粉样蛋白：脑内淀粉样蛋白斑块的形成和沉积是老年性痴呆(Alzheimer病)的病理特点，准确测量生物体液中的淀粉样蛋白含量对该病的研究有重要意义。

Szekeres等[11]建立的血清β淀粉样蛋白1-40和1-42 LOCI检测法灵敏度<2 pg/ml，且较ELISA分析方法更灵敏，适用于Alzheimer病的早期诊断。

5．其他：在心肌梗死的早期诊断和疗效评价方面，国内学者[12-13]用LOCI检测血清肌钙蛋白I和肌红蛋白。

结果表明该方法具有很高的灵敏度，对血红蛋白、总胆红素、三酰甘油等具有较好的抗干扰性，其方法学特性和临床检测性能可完全满足临床要求。

(三)核苷酸与前述的抗原-抗体免疫反应不同，LOCI技术对核苷酸的检测采用的是碱基互补配对原则和定量PCR扩增原理（图2）。

Patel等[14]采用该技术对目标DNA分别进行了实时(real-time)和终点(end-point)测量，可检测目标DNA浓度的范围分别为103倍和106倍，对单链DNA扩增片段的检测灵敏度达2-10 mol/L。

Beaudet等[15]将LOCI技术与等位基因特异性扩增(ASA)和等位基因特异性杂交(ASH)结合后。

建立了单核苷酸多态性(SNP)分析平台，可对基因组DNA 每个基因型进行精确定量，其灵敏度< 2 ng。

与目前绝大多数SNP分析方法比较，该技术省去了扩增后PCR产物纯化和酶反应过程，减少了污染，而且样本用量减少至2μl，为实现高通量检测提供了可行性。

图2光激化学发光法检测核苷酸原理简图（碱基互补配对原则）(四)配体与受体1．OX40和OX40L：OX40(CD134)属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，其配体OX40L与TNF具有同源性，属Ⅱ型膜蛋白，与CD4+T淋巴细胞介导的多种炎症效应有关，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、炎症性皮肤病和移植物抗宿主疾病等。

因此，高通量筛选OX40与OX40L特异性结合干扰物(拮抗剂)在药物开发(抗炎)领域具有非常重要的价值。

Wilson等[16]的研究表明，OX40和OX40L的特异性结合可被拮抗剂——苏拉明抑制，而且这种抑制作用在一定范围内具有浓度依赖性；研究者还试验了一系列OX40L结构类似物，筛选出了新的拮抗剂——PV肽(含31个氨基酸的短肽)，它在浓度为50μmol/L时，对反应的抑制率达73％，这无疑对抗炎药物的开发有重要价值。

2．孤儿核受体I型类固醇生成因子(SF-1)：SF·1作为核受体家族成员，在肾上腺和生殖腺等内分泌腺体及其上级控制中枢的分化与发育等方面发挥重要作用，是个体发育过程中最重要的内分泌功能调节因子之一。

因此，对其配体(内源性和外源性)及其拮抗剂和受体激动剂的甄别具有重要的基础研究和临床应用价值。

Li等[8]研究发现，SF-1的转录活性受磷脂调节，其与配体的相互作用因磷脂脂肪酸侧链长度不同，可表现为激活作用或抑制作用。

3．其他：众多学者用LOCI技术还研究了DAF-12受体-配体结合[9]、蛋白激酶及其抑制物[17]、蛋白质与多肽或基因之间的相互作用[17-20]，这些研究成果均为药物开发提供了新的思路和方向。

综上所述，LOCI技术实现了均相、一步、免清洗、免分离检测，使分析过程简单化，并彻底避免了由于清洗和分离所带来的误差，保持高度灵敏度和特异性；随着样本用量的大幅度减少，使检测小型化、芯片化和高通量成为可能，为临床超微量分析和新药开发提供了一个便捷高效的研究平台，也为科学研究提供了又一有力工具。

志谢：博阳生物(上海)科技有限公司赵卫国教授、吴旸技师等给予本研究协助参考文献[1] Ullman EF，Kirakossian H，Singh S，et a1. Luminescent oxygen channeling immunnoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence．Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91：5426-5430．[2] Ullman EF，Kirakossian H，Switchenko AC，et a1．Luminescent oxygen channeling assay(LOCI): sensitive，broadly applicable homogeneous immunoassay method．Clin Chem，1996，42：1518- 1526．[3] Kricka LJ．Clinical applications of chemiluminescence．Anal Chlm Acta，2003，500：279-286．[4] Peppard J，Glickman F，He Y，et a1．Development 0f a high-throughput screening assay for inhibitors of aggrecan cleavage using luminescent oxygen channeling(Alphascreen)．J Biomol Screen。