白血病微小残留病
Initial Therapy of AML
Diagnosis
• Complete remission (CR) must be attained to cure patient • CR defined as:
— Clearance of peripheral blood & bone marrow of leukemic blasts — Reconstitution of normal hematopoiesis — Resolution of leukemic infiltrates

白血病细胞负荷
初次诊断 --- 1012 形态学缓解 --- 1010以下 分子学缓解 --- 约106-107
Acute leukemia and CML
Concept of minimal residual disease (MRD)
Cell number
1012 1010
Morphological detection limit



在PCR反应体系中加入荧光基 团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。 实现了PCR从定性到定量的飞 跃，它以其特异性强、灵敏度 高、重复性好、定量准确、速 度快、全封闭反应等优点成为 了分子生物学研究中的重要工 具 目前real-time Q-PCR实验成本 比较高，且各实验室标准不一， 从而也限制了其广泛的应用。
inv(16)(p13q22)/t(16;16) CBFP-MYHII
见于约10%AML患者，主要为M4EO
带有该染色体融合基因者化疗缓解率高，但
中枢神经系统白血病的发生率也较高 定性测定其阳性对预后评估并无价值，甚至 有矛盾结果，同AML1-ETO,定量PCR显示出 对提示长期预后的作用


Prognostic relevance of fusion gene expression levels at diagnosis. Overall survival (OS) and event-free survival (EFS) for patients separated according to the 75%-percentile of the expression level of the respective fusion transcript


t(8;21)(q22;q22)

AMLI-ET0
最为常见的AML染色体异常,见于12-15%AML患者,主要为 M2b,少数见于M4和儿童ALL,并常见于年轻人
可伴有其他染色体异常,最常见为X或Y染色体缺失 携有该染色体的白血病细胞可分化至较成熟粒细胞,对化疗敏 感性较好，是克隆性染色体异常中预后相对较好的一类，但 仍有大于1/3患者最后复发 监测AML1-ETO是否阳性对提示长期预后意义有限，近年来 QRT-PCR定量监测其动态变化已显示出价值


MRD 检测在AML中的应用
评价AML治疗预后因素
诱导治疗后白血病细胞负荷减少程度及达到
CR时间被认为是提示预后的独立因素
MRD检测目的：预示分子学复发，尽早解救治疗
特殊遗传学改变的AML

最常见的三种染色体改变及融合基因
- t(8;21)(q22;q22) AMLI-ET0 - t(15;17)(q22;q11-22) PML-RARA - inv(16)(p13q22)/t(16;16) CBFP-MYHII *约占所有AML染色体改变的20%，具有以上改变者预 后良好 ,但仍 有10-30%治疗失败
血液学复发 CT
血液学复发 CT+allo-SCT 3 died; 2 in CCR(62,74) 血液学复发 CT+ASCT 2 died of the disease
结论:MRD持续阳性者宜尽早移植
维持治疗期间和以后的MRD监测

MDR监测适合于高危组患者，低危组患者似乎不需要监测 目前推荐：高危组患者巩固治疗后1年内每1-2个月检测1次， 第2、3年每3个月1次 目前常用非定量RT-PCR，Q-RT-PCR的临床应用价值有待 确定，但认为动态监测融合基因定量变化可为评估预后提 供有益信息，便于调整治疗方案 巩固治疗后RT-PCR持续阴性与长期生存密切相关 一旦转为阳性提示即将血液学复发，需及时治疗
Remission Induction Post-remission Therapy
Consolidation Chemotherapy
SCT
定义

Minimal residual disease(MRD)---微小残留病
指白血病诱导化疗完全缓解后或者骨髓移植后残留在体内少 量白血病细胞的状态,可能是导致白血病复发的根源
优点：FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、 能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显 示于间期核.



Interphase and metaphase FISH demonstrating a variant of the Philadelphia chromosome. The genes that are rearranged are: BCR(green on chromosome 22)/ABL (orange on chromosome 9) The Ph’ translocation appears as dual fusion (yellow) signals.
染色体核型分析
常用染色体显带技术检测出染色体畸变,但其
成功率依赖于标本中分裂象细胞的数量多少， 从而使得检测结果各不相同，且敏感度较低， 约1：20
FISH fluorescence

in situ hybridization
用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针， 通过与间期细胞核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色 体数目和结构的异常，可以进行定性、定位和相对定量分析 。
实验室 标准化基线 MMR 数 值*
Adelaide
80%
0.08%
London
Seattle
45%
15%
0.045%
0.015%
* 获得主要分子生物学治疗反应时BCR-ABL转录本绝对数量
Imatinib一线治疗12个月分子生物学治疗反应与无 进展生存
100
90 80 70
98% 90% 75%
RT-PCR 逆转录聚合酶链反应技术


利用染色体易位形成的 肿瘤特异融合基因或基 因重排作为分子靶，在 引物作用下，通过聚合 酶链反应，短时间内将 特异性序列扩增百万倍， 然后用凝胶电泳显示出 来 优点：特异性、灵敏度 大大提高（可达10-5— 10-6）
QRT-PCR---荧光实时定量PCR
% 无疾病进展
60
50 40 30 下降>=3对数级 下降<3对数级
p<0.001
n=136 n= 94 n=138
20
10 0
获得完全细胞遗传学治疗反应
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 随机分组后时间（月）
QRT-PCR在AML中的应用
BCR-ABL转录本上升预示疾病复发
BCR-ABL转录本对数级下降
BCR-ABL not detected 与丢失完全细胞遗传学治疗反应比较；分 子生物学监测可更早提示疾病复发 BCR-ABL detected
基线
1.0
丢失完全细胞遗传学治疗反应
供体淋巴细胞回输
MCR CCR
Ph染色体转阴
2.0 3.0 4.0
Burnett AK，et al.Blood1999;93:4131
巩固治疗结束后MRD状态与复发的关系
RT-PCR （+） RT-PCR （-）
P
N
3yr Relapse
7
57%
69
27% 0.006
Italian GIMEMA-AIEOP Trial——AIDA protocol Breccia M,et
106
PCR detection limit
I
Time
检测MRD的意义
根据细胞负荷调整缓解后化疗方案
更早发现药物耐药性 更早预测白血病复发 评价骨髓移植净化效果 为实验研究提供依据
MRD主要检测方法
一、染色体核型分析 二、荧光原位杂交--- FISH 三、流式细胞仪---FCM 四、聚合酶链反应技术---PCR 五、其他：细胞培养技术，免疫荧光等

其他染色体异常 t(9; 11 )(p21-22;q23) MLL-AF9 t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL t(6;9)(p23;q34) DEK-CAN
APL-t(15;17)(q22;q11-22)
90-95%
PML-RAR α
PML-RARα(+)患者在诱导或巩固治 疗后阶段可达转为阴性 PML-RAR α持续阳性或由阴转阳则预示即将 发生血液学复发 巩固及维持治疗阶段监测融合基因对调整治 疗方案有指导意义 但是融合基因持续阴性并不代表不会复发
Karyotype showing the Philadelphia chromosome. 46,XX,t(9;22)(q34.1;q11.2)

Figure 5: Detection of PML-RARa gene fusion by interphase FISH: Left: S-FISH (one wild type PML, one wild type RARa, and one yellow fusion signal); Right: D-FISH (one wild type PML, one wild type RARa, and two yellow fusion signals).