ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒
ELISA法筛查α-地中海贫血 ELISA法定量检测乙肝抗原两对半
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基础医学领域的应用 ----ELISA试剂盒商业资讯
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ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
法医物证
环境卫生
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酶催化底物液显色
DH2+ H2O2 D+ 2H2O
第 一
管
管
100µL
第 二
管
S
100µL
第 十
管
600µL
300µL
300µL
300µL
1:400 A
1:1600
1:6400
B
123 4
5
6
78
每孔100ul,上下两排一致
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9 10 11
从低浓度往 高浓度加,
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ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
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结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变 浅
待检样品孔显色明显
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空白对照
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ELISA标准曲线
Ab浓度（ng/ml）
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注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高
浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 将加样枪调到最大量程（见加样枪顶部数字） 将所有剩余液体倒入水池，所有塑料制品开盖回
鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
洗涤：3次，
→1min/次
EE 洗涤：3次， →1min/次
EE
→ 底物液 终止液终止显色 空白对照无显色
待测样品显色明显
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
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倍比稀释法与加样
样 品
100µL
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（一）直接法
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（二）间接法
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗体 以检测已与固相结合 的受检抗体，故称为 间接法。
其优点在于只要 变换包被抗原就可利 用同一酶标抗抗体建 立检测相应抗体的方 法。可用于传染病的 诊断。
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（三）双抗体夹心法
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制 备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
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（四）竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体。
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不
能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药
物等ELISA测定多用此法。
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ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
收到讲台
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需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用
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酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
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1
操作步骤 每种液体均加100ul／孔
→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔抗
37 ℃ ，20min
鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
洗涤：3次，
→1min/次
EE 洗涤：3次， →1min/次
EE
→ 底物液 终止液终止显色 空白对照无显色
待测样品显色明显
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
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2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
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5
同位素131I标记抗体指示小鼠肿瘤
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6
免
疫
荧
光
技
术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
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课程内容
ELISA的原理 ELISA的分类 间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例
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8
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）
洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）
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显色液：OPD（邻苯二胺）
操作步骤
每种液体均加100ul
→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔抗
37 ℃ 30min
E
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色
的产物。
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结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越 深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据 颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长 （OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
2.抗原或抗体的固相化
3.抗原或抗体的酶标记
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E
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间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG
酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG
聚苯乙烯酶标板 水浴箱
移液器
枪头
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液
封闭液/ 封：5%脱脂奶粉