免疫酶斑点试验 Dot-ELISA
实验目的
1.了解免疫酶斑点技术的基本原理 及方法；
2.了解免疫酶斑点技术的用途。
免疫斑点酶技术的原理
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强 的静电吸附力, 在中性条件下即可有效 地吸附蛋白质等生物大分子。
将免疫物质吸附于纤维素膜后，就可利 用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。
7. 将膜片放入底物液中, 震荡15分钟左右观察。 明显棕色斑点者为阳性
实验结果
免疫斑点试验的影响因素
1. 包被NC膜的抗原浓度对试验结果影响较大。 多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度 过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
2. 酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最 适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具 体条件作方阵滴定来确定。
方法(直接法)
1. 取硝酸纤维素膜片, 用笔做好标记方便加样; 2. 将稀释的抗原液2μl加于相应格内,室温自然干 燥! 3. 将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟;
4. 用洗涤液震荡洗3次, 每次1分钟, 吸干;
5. 将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡 15分钟, 吸干;
钟, 吸干;
免疫酶斑点技术的特点
1. Ag-Ab反应—高特异性 2. 酶催化作用的高效性—高敏感性 3. NC膜的运用—微量抗原的检测
实验方法及注意事项
1. 分组为单位 (两桌为一组)
2. 膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台
上 3.
酶标抗体放置在冰箱，使用前取出
4. 底物临用前配置
5. 震荡器全班一台, 调整好频率后不要乱动
3. 显色时间，一般认为5-10分钟较好。显 色时间过长常导致本底着色加深，降低试 验的特异性。
4. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品 加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品 混淆，一般5～10μl即可。
免疫酶斑点技术的应用
1. 微量抗原的检查; 2. 抗体分泌细胞、细胞因子产生细胞 的筛选; 3. 自身抗体的检查。