真菌α-淀粉酶的研究和应用16120901 20092348 王德美摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
α-淀粉酶在现代淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制及生料酒精等行业已得到广泛的应用。
随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌α-淀粉酶的使用需求，使得真菌α-淀粉酶在现代工业酶制剂中占有重要地位。
对真菌α-淀粉酶的研究和利用，为满足国内市场需求、调整我国酶制剂工业结构和带动相关食品或发酵行业的发展等具有重要意义。
关键词：真菌α-淀粉酶，可发酵性糖，固态发酵，冷冻沉析，食品应用1.真菌α-淀粉酶的结构及其催化机制1.1真菌α-淀粉酶的结构与大多数α-淀粉酶类似，真菌α-淀粉酶通常含有三个结构域，分别称为A、B和C。
结构域A为酶的催化反应中心区域，其典型结构为（a/b）8TIM-桶状结构，结构域B和结构域C基本上位于结构域A得到对立两端【1】。
其中，Ca2+的保守结合位点位于结构域A和结构域B之间的表面区域，而大多数情况下Ca2+的存在对于α-淀粉酶家族保持其酶活力和稳定性是必须的。
结构域B位于TIM-桶状结构域的第三个β-折叠和第三个α-螺旋之间，该区域富含不规则的β-片层结构，在不同的淀粉酶中的大小和结构差异较大，被认为与α-淀粉酶的第五特异性有关。
同时，通过定点突变或随机突变结果表明，该部位在淀粉酶中核能相对比较脆弱，与α-淀粉酶的总体稳定性关联密切，其中部分氨基酸的改变对酶的pH稳定性和热稳定性影响较为显著。
结构域C形成α-淀粉酶蛋白质羧基端，并含有α-淀粉酶家族所特有的希腊钥匙β-sandwich结构，通常认为其通过将结构域A的疏水区域与溶剂相隔离以稳定催化区域或TIM桶状结构【2】。
1.2真菌α-淀粉酶的催化机制通过X-射线晶体结构、化学修饰和定点突变等手段，表明Asp206、Glu230和Asp2973个氨基酸可能是α-淀粉酶、家族的核心催化位点【3】。
在α-淀粉酶的催化过程中，酶首先固定住异头物(α-构象)，然后通过双替换反应进行催化。
在第一个替换过程中，酶的酸性基团(Glu230)使糖苷中的氧原子质子化，并使碳和氧的链接键断裂，形成一种鎓盐转换状态，继而在第二个替换过程中由蛋白的亲质子酸性基团对糖的异头物中心进行攻击，形成β-糖基和酶复合的一种临时状态，继而底物的糖基配基离开活性位点。
2.真菌α-淀粉酶的分类在目前已报道的文献中，各种真菌来源的α-淀粉酶可以粗略的按酶学性质或作用条件将真菌α-淀粉酶分为3种类型：2.1中性真菌α-淀粉酶与细菌α-淀粉酶不同，真菌α-淀粉酶的来源相对较少，大多数真菌α-淀粉酶的作用温度和pH都比较温和，如最适作用pH在5.0~5.5之间，最适作用温度为50~55℃左右，当温度超过60℃酶开始失活。
目前商品化生产最多、应用也最为广泛的来源于米曲霉(变种)的α-淀粉酶即属于这一酶种。
2.2耐热或耐酸性真菌α-淀粉酶此类酶在pH2.5~4.5之间，作用温度在超过60℃时仍具有良好的热稳定性。
与中性真菌α-淀粉酶相比，具有耐热或耐酸性真菌α-淀粉酶可以简化液化、糖化过程，减少制糖等淀粉深加工过程中染菌几率并降低相应生产成本【4】。
这部分酶种目前工业上已经开始生产使用，且具有很大的开发利用潜力。
2.3具有生淀粉酶活力的真菌α-淀粉酶该酶除具有水解可溶性淀粉或其他糊化淀粉能力外，还具有生淀粉水解能力，在生料酒精行业的同步糖化发酵(SSF)中，与糖化酶配合使用，可以大幅度提高淀粉的利用速率和效率，并有效提高酒精产率【5】。
3.产淀粉酶的真菌的分离筛选及初步鉴定生淀粉酶能将未经蒸煮糊化的生淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖供微生物生长与代谢，其比传统的高温蒸煮糖化节约25%~30%的能耗。
因此，在生料酒精发酵、酿酒、酿造调味品以及饲料蛋白生产等领域有着巨大的应用价值。
据有关资料报道【6】，很多微生物诸如黑曲霉、根霉等真菌具有直接降解生淀粉的能力，生料发酵具有可行性，其关键是选育出生淀粉分解能力强的菌株。
朱文优等人醋曲、大曲及酿造厂附近土壤样品中，筛选出Y14、Y15、Y19、Y18和Y22等5株具有较强生淀粉分解能力的菌株，并对其进行了初步鉴定。
富集培养基为玉米淀粉40g，麸皮10g，酵母膏3g，K2HPO41g，MgSO4•7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，氯霉素0.005g，pH5.5~6.0，定容1L后灭菌。
分离培养基为玉米淀粉20g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4•7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂粉13g，氯霉素0.005g，定容1L中，pH5.5~6.0。
制备时，将除玉米淀粉以外的成分于121℃灭菌30min，冷却到45℃，红薯淀粉用甲醛熏蒸2h灭菌，再经105℃干热2h，最后两者混合。
初选培养基为玉米淀粉15g，酵母膏1.5g，K2HPO41.0g，NaNO31.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂粉13g，定容1L中，pH5.5~6.0。
制备时，将除玉米淀粉以外的成分于灭菌，冷却到45℃，玉米淀粉用甲醛熏蒸2h灭菌，再经105℃干热2h，最后两者混合。
复选培养基为麸皮12.5g，水为12.5mL，装于300mL三角瓶中灭菌进行粗酶制备时向复选培养基中接入3~4环菌株，然后置于30℃恒温培养箱中培养72h，培养期间每隔24h翻动一次。
经初步鉴定，这5株有较强生淀粉分解能力的菌株，分解能力分别为31.87%、30.04%、29.15%、23.98%和23.6%。
菌株Y14和Y18为米曲霉，菌株Y15为少根根霉，菌株Y19和Y22为黑曲霉。
上述5株真菌作为出发菌株，通过诱变育种和混株发酵研究，以期获得可工业化应用的复合生料糖化曲【7】。
4.真菌α-淀粉酶固态发酵条件研究真菌α-淀粉酶热稳定性较差，65℃以下就已失活，不会造成面团心发粘的质量问题。
因此近年来，在我国面粉生产企业中，真菌α-淀粉酶已逐步得到推广与应用，并取得了良好的经济与社会效益。
而且除了在面粉工业中的应用外，真菌α-淀粉酶在淀粉糖工业和酿造工业中也有非常广泛的用途【8】。
真菌α-淀粉酶也成为一个引人关注的高效新型工业酶种，引起了许多研究者的关注【9】。
刘仲敏等人通过对米曲霉ZLF13固态发酵生产真菌α-淀粉酶的培养基要求及发酵工艺条件进行研究，采用500L固体发酵罐进行放大试验，最终确定发酵生产真菌α-淀粉酶的培养基配比、工艺条件和工艺参数，为该酶的批量生产提供了可靠的工艺技术依据。
在完成工艺研究的基础上，又对真菌α-淀粉酶的酶学性质进行了试验研究，了解和掌握了该酶的相关酶学性质，为真菌α-淀粉酶的应用提供了参考依据【10】。
结果表明，以麸皮和适量淀粉为主要原料，添加1号复合无机盐，保持培养基水体积分数为60%～65%，控制培养温度30～34℃，发酵周期65～70h。
中试平均酶活力1283U/g。
通过对其酶学性质的研究发现，米曲霉ZLF13所产真菌α-淀粉酶最适作用温度为55℃，最适作用pH值为4.8～5.4；65℃以上迅速失活【11】。
5.真菌α-淀粉酶制剂的提纯及保存方法酶制剂作为一类重要的催化剂和添加剂,其物理性状应满足应用行业的加工工艺要求。
固态发酵生产的真菌α-淀粉酶粗制品(发酵曲)虽然在酶学作用方面可以满足相关应用行业的需要,但由于粗制品的杂质多,导致其在部分食品工业中的应用受到限制。
目前国内尚不能工业化批量生产真菌α-淀粉酶,对于该酶的分离、提纯方面所做的研究工作也甚少。
近年来，刘仲敏等人在完成了真菌α-淀粉酶高产菌株诱变选育和固态发酵工艺及酶学性质研究的基础上,开展了真菌α-淀粉酶的分离、提纯工艺研究和产品保存研究,确定了以浸提、压滤、超滤浓缩和冷冻沉析为主的工艺技术路线和工艺条件,形成了一套完整的真菌α-淀粉酶分离提取工艺技术。
并采用该工艺技术开发生产了食品级精制真菌α-淀粉酶制剂。
同时,通过试验研究,确定了食品级真菌α-淀粉酶制剂的保存方法。
通过对真菌α-淀粉酶提取工艺条件的研究和优化试验,其最佳提取工艺条件为:培养好的发酵曲采用40℃温水,pH值7.5左右,加水比为1：4,浸泡3h。
压滤滤液经超滤浓缩后,在10—15℃,pH6.0—6.5,加入食用酒精至体积分数为70%,静置过滤,40℃鼓风干燥。
采用该工艺条件,产品综合回收率稳定在70%以上,最高达到74%,产品酶活力最高达25416u/g,平均达16608u/g。
经过对精制酶保存方法的研究,确定了一种可有效保存真菌A-淀粉酶的稳定剂配方,用于精制酶的保存,半年的酶活力保存率可达到95%以上,1年的保存率达到90%以上,产品经国家轻工业食品质量监督监测郑州站检测,完全符合中华人民共和国行业标准(QB180511)1993工业用A-淀粉酶制剂)食品级要求【12】。
6.α-淀粉酶的应用由于真菌α-淀粉酶所特有的性质，如反应温度温和，作用pH偏中性等，使得真菌α-淀粉酶在实际应用中主要应用于淀粉的糖化。
与细菌α-淀粉酶相比，真菌α-淀粉酶的应用主要集中在食品应用领域。
6.1高麦芽糖浆的生产麦芽糖浆是以淀粉质为原料，经酶或酸酶结合的方法水解而成的以麦芽糖为主的糖浆，根据麦芽糖的含量不同大致可以分为饴糖(麦芽糖含量20%－30%)、高麦芽糖浆(麦芽糖含量40%－60%)、超高麦芽糖浆(麦芽糖含量大于70%)和结晶麦芽糖等。
高麦芽糖浆的甜度低而温和，可口性强，在高温和酸性条件下比较稳定，具有熬煮温度高、不易发生美拉德反应等优点。
在食品行业，对面包、糕点及烘焙食品等加工过程具有防止淀粉老化、保湿和延长保质期等作用;在蜜饯、方便食品、酱油、糖果、口服液、保健饮品、麦乳精和冷冻食品等食品行业作为营养甜味剂、填充剂得到广泛应用;在医药行业，可添加至多种中药中使用，具有润肺、补虚、止咳及治疗腰痛等作用。
此外，超高麦芽糖浆在加氢氢化后可生成麦芽糖醇。
麦芽糖醇是一种甜度与蔗糖相当而热量值较低的甜味剂，也是制备另一种功能性食品原料麦芽糖酮糖和低聚异麦芽糖的原料。
6.2焙烤制品美国和英国分别在1955年和1963年确定了真菌α-淀粉酶为一般视为安全的(GRASstatus)添加剂，并允许在面包焙制过程中使用。
目前，在全世界范围内均得到不同程度的应用。
由于中性真菌α-淀粉酶不耐热等特点，在面团发酵过程中容易通过加热使之失活，利于控制面团的发酵速度和程度，以免作用时间过长产生大量糊精以致面包心发黏。
真菌α-淀粉酶可水解面粉中的受损淀粉生成小分子糊精，通过酵母的进一步发酵产生醇类物质和二氧化碳，从而使面包体积增大。