生物信息学论文学院：生命科学技术学院专业：生物科学班级：2013级老师：***学生：王秉政学号：***********黑曲霉GH75及米曲霉GH76-5基因生物信息学分析王秉政（黑龙江八一农垦大学，生命科学技术学院，2013级生物科学专业，黑龙江省，大庆市）【摘要】目的：分析和预测黑曲霉GH75和米曲霉GH76-5基因及其编码蛋白质的结构和特征。
方法：利用NCBI、CBS和ExPASy网站中的各种信息分析工具，并结合VectorNTIsuite8.0生物信息分析软件包，分析预测黑曲霉GH75和米曲霉GH76-5基因并预测该基因编码蛋白结构的特征和功能。
结果：GH75基因全长174bp,编码区具有57个氨基酸，在GenBank同源序列中，基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH75保守域。
GH75蛋白相对分子量预测为26257.2，理论等电点为4.69。
预测GH75编码蛋白α螺旋(H ) 、β折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是11.07%、25.41%、63.52%，1个GTPase结构域。
GH75编码区具有102个氨基酸，在GenBank同源序列中，其与列一致性达到100%，且有GH76-5保守域。
GH76-5蛋白相对分子量预测为46029.3，理论等电点为5.28。
预测GH76-5编码蛋白α螺旋(H ) 、β折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是26.90%、20.71%、52.38%，2个GTPase结构域。
GH76-5蛋白为疏水蛋白，无跨膜区，无信号肽。
结论：成功预测GH75和GH76-5基因及其编码蛋白生化及其结构特征，为下一步对其进行克隆和表达奠定基础。
【关键词】黑曲霉、米曲霉；糖基水解酶家族（GH75）；糖基水解酶家族（GH76-5）生物信息学黑曲霉是一种重要工业微生物,在酶制剂、异源蛋白、有机酸等领域应用广泛。
2007年黑曲霉基因组的公布将黑曲霉的研究引入后基因组时代,各种组学数据如雨后春笋般涌现,人们对黑曲霉高效生产机制的理解上升到系统、分子层次;与此同时,黑曲霉遗传操作系统也不断成熟,为系统地研究和改造黑曲霉、将黑曲霉打造成通用细胞工厂奠定了基础。
米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
一、资料与方法1.1资料通过ExPASy 数据库的UniProtKB（或/uniprot）获得黑曲霉的GH75与米曲霉GH76-5基因序列。
GH75基因编号为4990860.，NCBI的登录号为XM_001401782.1. ，其他物种的GH75的氨基酸序列均来自Genbank，登录号见图1。
GH76-5基因编号为4987208.，NCBI的登录号为XM_001400940.2. ，其他物种的GH76-5的氨基酸序列均来自Genbank，登录号见图2。
1.2方法利用美国国家生物技术信息中心（NCBI,）的基本局部比对搜索工具（BLAST,/blast/），运用Blastx完成基因同源性分析。
应用ORF finder（/gorf/orfig.cgi）寻找其开放读码框，并推导出可编码蛋白序列。
利用保守结构域（/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析预测其保守域。
通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASy，）所提供的蛋白组学和分析工具：Protparam 程序分析GH75及GH76-5蛋白氨基酸组成、相对分子质量、等电点等基本理化性质；TMHMM 程序预测GH75及GH76-5的跨膜区；Proscale 程序分析GH75及GH76-5的蛋白性质；SignalP 程序预测GH75及GH76-5蛋白的信号肽，GOR 超链接分析GH75及GH76-5的二级结构，SWISS-MODEL 通过二级结构比对和折叠，模拟蛋白质的空间构象。
利用SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）分析预测其结构域。
二、结果2.1基因序列的分析 BLASTx 分析结果表明，GH75与多个物种的GH5基因同源，其中与Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig 的同源性最高，一致性达100%，相似度达99%（图1）。
ORF Finder 获得其开放阅读框编码氨基酸序列，该基因全长174bp,编码区为2-174bp ，编码57个氨基酸，无起始密码子，终止密码子TAA ，不编码蛋白（图3）。
CCD 分析发现有GH75保守域。
BLASTx 分析结果表明，GH76-5与多个物种的GH6基因同源，其中与Aspergillus niger contig An14c0130, genomic contig 的同源性最高，一致性达100%，相似性达100%（图2）。
ORF Finder 获得其开放阅读框编码氨基酸序列，该基因全长309bp,编码区为1-308bp ，编码102个氨基酸，无起始密码子，终止密码子TGA ，不编码蛋白（图4）。
CCD 分析发现有GH76-5保守域。
2.2编码蛋白的特征分析2.2.1蛋白质的基本参数GH75蛋白相对分子量预测为26257.2，理论等电点为4.69，脂肪系数为75.94。
在溶液中的不稳定系图3 ORF Finder 图1 BLASTx图2 BLASTx图4 ORF Finder数是25.26，为稳定蛋白。
当蛋氨酸在N 端时，可预测其在哺乳动物网织红细胞（体外）中，半衰期均30小时，在酵母（体内）中，半衰期大于20小时，在大肠杆菌（体内）中，大于10小时。
氨基酸的组合物（图5），原子组成（图6）。
带负电荷的残基总数13，带正电荷的残基总数27。
当蛋白浓度为1g/L ，所有的半胱氨酸残基形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS ）为1.629，在水中280nm 摩尔消光指数为42775；所有的半胱氨酸残基不形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS ）则为 1.615，在水溶液中280nm 摩尔消光指数为42400。
总的亲水性平均疏水性指数（grand average of hydropathieity ）为-0.204，预测为亲水蛋白。
GH76-5蛋白相对分子量预测为46029.3，理论等电点为5.28，脂肪系数为64.67。
在溶液中的不稳定系数是27.19，为稳定蛋白。
当蛋氨酸在N 端时，可预测其在哺乳动物网织红细胞（体外）中，半衰期均30小时，在酵母（体内）中，半衰期大于20小时，在大肠杆菌（体内）中，大于10小时。
氨基酸的组合物（图7），原子组成（图8）。
带负电荷的残基总数33，带正电荷的残基总数42。
当蛋白浓度为1g/L ，所有的半胱氨酸残基形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS ）为 1.970，在水中280nm 摩尔消光指数为90675；所有的半胱氨酸残基不形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS ）则为1.962，在水溶液中280nm 摩尔消光指数为90300。
总的亲水性平均疏水性指数（grand average of hydropathieity ）为-0.323，预测为亲水蛋白。
2.2.2疏水性分析、跨膜区分析TMHMM 预测GH75蛋白，提示有跨膜区，位于膜内（图9）。
Proscale 分析疏水性，结果也提示GH75为亲水蛋白（图10）。
SignalP 分析提示GH75有信号肽（图11）。
TMHMM 预测GH76-5蛋白，提示无跨膜区，位于膜外（图12）。
Proscale 分析疏水性，结果也提示GH75为疏水蛋白（图13）。
SignalP 分析提示GH76-5无信号肽（图14）。
图5 氨基酸组合物物 图6 原子组成 图7氨基酸组合图8 原子组成图9TMHMM图12 TMHMM图11 SignalP 图10Proscale图13 Proscale图14 SignalP2.2.3 二三级结构与结构域SMART预测可能存在1个小GTPase结构域（图15），GOR预测GH75编码蛋白二级结构中螺旋（H）、折叠（E）、无规则卷（L）的比例分别为11.07%、25.41%、63.52%，以无规则卷为主（图16）。
SWISS-MODEL 模拟GH75三维结构，应用vector NTI suite 软件包D molecule viewer显示蛋白质三维结构（图17）。
SMART预测可能存在2个小GTPase结构域（图18），GOR预测GH76-5编码蛋白二级结构中螺旋（H）、折叠（E）、无规则卷（L）的比例分别为26.90%、20.71%、52.38%，以无规则卷为主（图19）。
SWISS-MODEL 模拟GH76-5三维结构，应用vector NTI suite 软件包D molecule viewer显示蛋白质三维结构（图20）。
图15 SMART图16 GOR图17 D molecule viewer图20 D molecule viewer图18 SMART图19 GOR三、讨论GH75基因全长174bp,编码区具有57个氨基酸，在GenBank同源序列中，其与Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH75保守域。
GH75蛋白相对分子量预测为26257.2，理论等电点为4.69。
预测GH75编码蛋白α螺旋(H ) 、β折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是11.07%、25.41%、63.52%，1个GTPase结构域。
GH75蛋白为亲水蛋白，有跨膜区，有信号肽。
GH76-5基因全长309bp,编码区具有102个氨基酸，在GenBank同源序列中，其与Aspergillus niger contig An14c0130, genomic contig基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH76-5保守域。
GH76-5蛋白相对分子量预测为46029.3，理论等电点为5.28。
预测GH76-5编码蛋白α螺旋(H ) 、β折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是26.90%、20.71%、52.38%，2个GTPase结构域。