枸杞多糖的生化分析和降血糖活性摘要：本实验研究了枸杞多糖的纯化，表性特征和降血糖活性。

通过超滤膜分离获得水溶性多糖（LBP），并通过DEAE纤维素柱和Sephadex的色谱法进一步纯化G-150得到LBP3a和LBP3b。

分析表明LBP3b的平均分子量（Mw）为4.92kDa。

单糖组成分析显示，LBP3b由摩尔比为5.52：5.11：28.06：1.00：1.70的甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和木糖组成。

并通过UV，FTIR，NMR和SEM研究了LBP3b的初步结构特征。

体外细胞实验显示，LBP3b以剂量依赖的方式显著抑制葡萄糖的吸收。

研究表明LBP3b具有作为抗糖尿病药物的潜在用途。

1.引言糖尿病（DM）是指具有异常高水平的血糖的慢性代谢病，已经成为世界上主要的健康问题。

它是由胰岛素分泌缺乏或器官对胰岛素的反应减弱引起的。

包括1型和2型在内的DM在全球发病率急剧增加，到2030年估计超过4亿。

许多口服降糖药，如双胍类和磺酰脲类可用于治疗糖尿病，但这些药物是化学合成的，缺乏多剂量方案，且高成本，具有不良副作用和毒性。

因此，研究和发现新型更安全和更有效的替代品是至关重要的，其中传统的食用和药用资源已成为研究低血糖活性的焦点]。

枸杞，属于茄科，是中国著名的草药，已使用了2300多年。

目前，枸杞受欢迎的功能食品已被广泛使用，其具有很大功效，如减少血糖和血清脂质，滋养眼睛，肾脏和肝脏，抗辐射，提高免疫力，抗衰老，抗癌，抗疲劳，增强血细胞生成，改善男性不育。

据报道，枸杞果干中有胡萝卜素，氨基酸，微量矿物质，维生素，脂肪酸，多糖和甜菜碱与健康相关的生物活性成分。

在枸杞的这些化学成分中，最好研究的组分是水溶性的多糖（LBP）估计占干果的5-8％。

许多关于药理学和光化学的研究已经证明LBP是以上的生物活性的主要成分之一[15-17]。

然而，由于LBP的结构复杂性，不同的提取和纯化方法得到的LBP具有不同组分，结构和功能。

而每种LBP的结构和功能从未进行过全面和深入的讨论。

本研究通过超滤膜分离方法从枸杞果实中提取粗LBP，通过DEAE离子交换纤维素和Sephadex凝胶过滤的方法纯化粗LBP，使用前柱衍生高效液相色谱法鉴定单糖组成，然后确定LBP亚基的结构。

此外，进行体外细胞实验以评价LBP3b 的降低血糖的效应。

部分（LBP3b）通过UV，FT-IR，NMR和SEM测定表型特征。

2.材料和方法2.1. 材料和化学物质枸杞果实在宁夏回族自治区市场购买。

将植物材料干燥并在使用前储存在干燥的地方。

DEAE-纤维素，Sephadex G-150，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖，甘露糖，木糖和三氟乙酸（TFA）购自Sigma。

所有其他化学品和溶剂均为分析等级。

2.2. 粗多糖的制备多糖通过Yin和Dang的方法制备。

将枸杞果实的干果用搅拌器粉末化，并将研磨的样品浸入给定体积的60℃的热水中。

在一定条件下，混合的提取物通过有机膜进行超滤，其分离分子量从300至50kDa（从Suntar Membrane Technology Co.，Ltd.，Xiamen，China获得）。

超滤后用氯仿：甲醇（2:1）（v / v）的过滤液回流三次，以除去脂质。

过滤后，将残余物风干，然后再次用80％乙醇回流。

混合的滤液依次用95％乙醇，100％乙醇和丙酮沉淀。

过滤和离心后，收集沉淀物并真空干燥，得到粗LBP（CLBP）的粗多糖（糖缀合物）。

2.3. CLBP的分离和纯化CLBP用Sevag试剂脱蛋白3次，然后将所得多糖溶液冻干以得到粗产物。

将粗产物溶解并经受DEAE纤维素柱（OH - ，2.6cm×90cm），并用蒸馏水和0.05-0.5mol / l NaCl以30ml / h的流速洗脱。

通过自动级分收集器收集洗脱液并测定280nm处UV吸收和490nm的苯酚硫酸量。

并且获得称为LBP1，LBP2，LBP3和LBP4的四个均匀子级分。

其中含量最高的亚级分LBP3，使用Sephadex G-150柱（2.5cm×60cm）进一步纯化。

经离心，浓缩和冷冻干燥后，LBP3b用于后续实验。

通过苯酚 - 硫酸法[22]，使用d-葡萄糖作为标准样品，测得LBP3b 的总糖含量为96.53％。

2.4 . 单糖组成和分子量测定的分析LBP3b样品用三氟乙酸（TFA）水解，并由1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生。

LBP3b的单糖组成在ZORBAX Eclipse XDBC 18柱（250mm×4.6mm，Agilent，USA）上通过反相液相色谱（Agilent 1260，VWD检测器，美国）进行，流动相0.1mol / l PBS （pH6.7）：乙腈为83:17，流速1ml / min，温度30℃，进样体积为10μl。

检测在250℃ nm d-甘露糖，l-鼠李糖，d-葡萄糖，d-半乳糖，d-木糖，d-阿拉伯糖用作参考。

通过高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定LBP3b的平均分子量，将样品溶液置于装有Shodex OHpak SB-802HQ和Shodex OHpak SB-805HQ柱（8.0mm×300mm，ShowaDenko，Japan）的Agilent高效液相色谱（HPLC），用含有0.2mol / l NaCl 的0.1mol / l磷酸盐缓冲液（pH 5.5）洗脱，其流速为0.8ml / min，并通过Agilent 1260折射率检测器检测。

并用用已知分子量的葡聚糖P-82系列作为标准品（805000,339000,210000,48800,2700，10000，6000，180Da），制作标准曲线。

参照上述制作的标准曲线，估算LBP3b的分子量。

2.5. 紫外和FT-IR分析将均匀的LBP3b溶解稀释至适当的浓度，并用UV分光光度计（CARY50UV-vis，Agilent，USA）对其测定。

测定范围从200至500nm 。

同时用配备有OMNIC软件的傅里叶变换红外分光光度计（NEXUS 870，USA）测定LBP3b的FT-IR。

将LBP3b样品分别用KBr粉末研磨，然后压制为用于在4000-400cm -1的频率范围内进行变换红外光谱测量的粒料。

2.6. NMR分析通过冻干将多糖与DMSO中的氘交换三次。

并在NMR波谱仪（Brucker AVANCE III）上于600MHz记录1 H和13 C NMR光谱。

2.7. 扫描电子显微镜将多糖用金箔涂覆，并在高真空条件下，于5kV的加速电压下，用扫描电子显微镜系统（Hitachi S-3400N，Japan）检测，并将图像放大500至10000倍。

2.8. LBP3b对Caco-2细胞培养模型中葡萄糖吸收的影响细胞培养：从中国科学院（上海，中国）生物化学与细胞生物学研究所的细胞库得到了Caco-2细胞，细胞在含有10％胎牛血清DMEM培养基的25cm 塑料瓶中生长。

将它们置于37℃，5％CO 2和85-90％相对湿度的的环境中培养，每隔一天更换培养基。

指数生长的细胞用于实验。

并根据每个孔一定量的菌体浓度接种，将细胞接种在培养板上的Transwell聚碳酸酯膜中（Corninig，3413）。

在第一周期间每隔一天更换培养基，之后，每天一次，培养时间为19-21天。

通过用Millicell-ERS（Millipore Corp.）测量的跨膜电阻值评价单层完整性。

单细胞层的TEER≥300cm 。

说明细胞的生长是封闭膜，因此可以用作肠吸收的体外模型。

葡萄糖摄取测定：除去上述Caco-2单层细胞模型的培养基。

用2ml HBSS （pH7.2）洗涤细胞两次，第二次洗涤时于CO 2培养箱中静置20分钟。

根据实验组，将适量的葡萄糖和LBP3b溶于HBSS，过滤灭菌，在使用前加热至37℃。

MTT 测定法用来测试LBP3b对Caco-2细胞的毒性。

混合葡萄糖和（或者）混有HBSS 的LBP3b，连接0.1ml至AP侧，向BL侧加入0.7ml HBSS作为进料流体，并将它们放置在孵化器中。

在此期间，吸出AP侧的液体来检测过量的葡萄糖。

根据课程的数量，在小房间中将等量的液体再次放入AP侧。

葡萄糖的浓度通过葡萄糖氧化酶法估算，通过其在培养基中的减少量来计算葡萄糖的吸收量并且用mmol / l来表达。

管号管号图1.LBE在DEAE-纤维素柱上的洗脱曲线（A）; LBP3在Sephadex G-150柱上的洗脱曲线（B）。

2.9. 统计分析所有组的数据都用SPSS 18.0软件来统计评估，通过方差（ANOVA）的单向分析来进行统计分析，区别测试和对照研究的方法的意义由学生的t检验确立，P值小于0.05被认为是显着的，所有结果表示为每组的平均值为±SD（n = 5）。

3.结果与讨论3.1. 提取CLBP称为CLBP的粗多糖从L.barbarum果实通过超滤膜分离的方法萃取出来。

根据个人的因素实验的结果，正交实验表明影响膜通量的主要因素是物质的温度和操作压力。

考虑到膜的使用寿命和生产成本，综合这些因素，结果表明最优的工艺温度是30℃，使用中性物质的工作压力为0.25 MPa。

3.2. CLBP的纯化按照上面所述从大麦杆菌L.中分离CLBP。

在流速0.5ml / min条件下，将CLBP在带有蒸馏水和0.05-0.5mol / l NaCl的DEAE纤维素柱（OH-，2.6cm×90cm）上纯化，通过自动馏分收集器收集洗脱液并通过在280nm条件下的UV吸收进行监测以及在490nm下测定苯酚硫酸。

将洗脱物分成四部分，分别命名为LBP1，LBP2，LBP3和LBP4（图1A）。

使用Sephadex G-150进一步纯化亚级分LBP3柱（2.5cm×60cm），得到另外两种纯化的组分，命名为LBP3a和LBP3b（图1B）。

从洗脱曲线来看，多糖（490nm）和蛋白质（280nm）的洗脱峰通常发生在相同位置。

这表明多糖可以与蛋白质组合存在。

3.3. LBP3b的分子量和单糖分析LBP3b的HPGPC如图2所示。

根据基于P-82系列葡聚糖标准[log（MW）= 0.00228t3-0.24764t2 + 8.58241t-90.4349（R2 =0.9961，t = 36.716min）]的标准曲线测定，其分子量为4.92kDa。

通过柱前衍生化高效液相色谱分析LBP3b中的单糖组成。

LBP3b的单糖组成在标准糖的HPLC保留时间的基础上来分析（图3A）。

很明显，有六种标准单糖组合物被鉴定了，从低到高，D-甘露糖的保留时间为11.618 min，鼠李糖为15.435分钟，d-葡萄糖为22.474分钟，d-半乳糖为25.225分钟，d-木糖为26.898分钟，并且d-阿拉伯糖为27.493分钟。