高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育学校河北农业大学专业生命科学学院姓名xxx学号x指导老师x同组人员x二〇一三年十二月二十五日（河北农业大学生命科学学院，河北保定，071000）摘要：目的：通过筛选诱变选育高产蛋白酶，为食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业提供材料基础。
方法: 通过在富含蛋白质的场所的针对性采集土样，菌落平板筛选结合紫外线诱变育种，选育高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过一系列鉴别性培养基鉴定其生理生化特性，查找其种属。
结果：通过筛选得到一诱变菌种，通过伯杰氏手册鉴定其为枯草芽孢杆菌属。
诱变90s后，其蛋白酶活性提高最大。
关键词：高产蛋白酶芽孢杆菌诱变鉴定引言：蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。
蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。
蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。
由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。
常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。
本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，筛选得到高产蛋白酶菌株。
High protease of Bacillus Strain BreedingAbstract:Objective: by screening the mutation breeding of high yield protease, food, pharmaceutical, cosmetics, detergent, spinning, fur softening provides basic material industry. Methods: the protein rich places for collecting soil samples, colony plate screening combined with ultraviolet mutagenesis breeding, breeding of high yield protease of Bacillus, cultivate their physiological and biochemical characteristics based identification through a series of differential, find the species. Results: by screening a mutagenic strain, through Berger's manual was identified as Bacillus subtilis. Mutation in 90s, the protease activity increased.Keywords: high yield protease from Bacillus mutagenesis and identification目录1材料和方法 (3)1.1 试验材料 (3)1.1.1 供试材料及菌株 (3)1.1.2 供试试剂 (4)1.1.3 供试培养基、营养液的配备 (4)1.1.4 主要仪器和设备 (4)1.2方法 (4)1.2.1菌株的分离筛选 (4)1.2.2 菌株的纯化 (4)1.2.3 紫外诱变 (5)1.2.5 生理生化鉴定 (5)2结果分析 (7)2.1菌落分离筛选结果 (7)2.2诱变后菌落观察结果 (7)2.3生理生化鉴定结果 (8)3讨论 (9)1材料和方法1.1 试验材料1.1.1 供试材料及菌株地表下10~15cm的土壤（取自河北农大西校区E座旁的小树林）及筛选获得的蛋白酶产生菌株1.1.2 供试试剂吲哚试剂，40%氢氧化钾，α—萘酚，香柏油，碘液，结晶紫染液，蒸馏水等1.1.3 供试培养基、营养液的配备改良牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉20g，加水定容至1L,调pH至7.4 用前加入适量牛奶，硝酸盐还原试验培养基：硝酸钾0.2g ，蛋白胨5g，加入1000ml蒸馏水中溶解，调pH至7.4，硝酸盐还原试验A液：对氨基苯硫酸0.5g，冰醋酸（10%左右）150ml，硝酸盐还原试验B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，冰醋酸（10%左右）150ml，石蕊牛奶培养基：2.5%石蕊4ml，脱脂牛奶100ml（10g奶粉溶于1000ml水中），VP试验培养基：磷酸氢二钾5g，多价胨7g，葡萄糖5g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH至7.8葡萄糖发酵培养基：磷酸氢二铵1g，酵母膏0.2g，氯化钾0.2g，葡萄糖10g，七水和硫酸镁0.2g，溴甲酚紫0.04%20ml，溶于1000ml水中，加入琼脂5-6g，加热煮沸，淀粉培养基：1g淀粉，10ml冷水和100ml营养琼脂，加热煮沸混合，柠檬酸盐培养基：氯化钠5g，七水和硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸5g，溴麝香草酚蓝溶液4ml，酚红试剂适量，校正pH6.8，加入琼脂2g熔化（试管斜面），吲哚试验培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。
调pH至7.6。
以上各种培养基在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
1.1.4 主要仪器和设备恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴锅，磁力搅拌器，显微镜，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环（针），酒精灯，载玻片，吸水纸、显微镜等。
1.2方法1.2.1菌株的分离筛选制备平板:融化牛肉膏蛋白胨培养基，每瓶加入20ml无菌牛奶，混合后倒平板6个，贴上标签，制菌悬液:称5g土壤溶于45ml无菌水中，震荡，80℃水浴10分钟，静置后取上清1ml 加入9ml无菌水于灭菌试管中混匀，，分别配成10-1、10-2、10-3、10-4的梯度稀释液，并编号。
涂布:取10-2、10-3、10-4的稀释液1ml，均匀涂布于牛奶平板上，每种浓度倒两个板。
培养:37℃倒置培养。
1.2.2 菌株的纯化挑取具有蛋白水解圈的菌落于另一个平板上划线纯化，经斜面培养后于4℃冰箱中保存，用接种环挑取初筛得到的菌接种至5mL 液体发酵培养基中，37℃ 230r/min 条件下振荡培养，4000rpm/min 离心10分钟，弃去培养基取上清液备用。
1.2.3 紫外诱变将上述上清液6000rpm/min 离心10分钟，弃上清后用无菌生理盐水重悬，取1ml 菌液，做10倍梯度的稀释，分别为10-4、10-5、10-6的菌液0.1ml 涂布平板，剩余的菌悬液倒入一个无菌空平皿，放一根无菌大头针，置于磁力搅拌器上。
紫外预热20分钟，将平皿打开盖，分别取照射30秒、1分钟、1分30秒、和2分钟的菌悬液做10倍梯度稀释（如图1），最后取0.1ml 涂布平板，平皿置于黑暗处培养。
（紫外线诱变需注意黑暗条件下操作，避免光复活现象。
）1.2.4 高产蛋白酶菌株选育取出培养皿，观察菌落形态，记录菌落个数，记录透明圈直径（H ）、菌落直径(C)及其比值、对比诱变前，是否有明显变化，即诱变是否成功。
并绘制存活曲线。
1.2.5 生理生化鉴定1.2.5.1硝酸盐还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氨气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法：用接种环挑取菌落接种于配好的硝酸盐培养基中，培养一周然后进行试验。
临试前将试剂的A 液和B 液各0.2ml 等量混合、取混合试剂约0.1ml ，加于试管内硝酸盐培养基中，立即或较快时间内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。
记录结果。
1.2.5.2石蕊牛奶试验组别 类别照射时间/s浓度梯度/ml一组 30 10-4 10-5 10-6 二组 60 10-3 10-4 10-5 三组 90 10-210-310-4四组 120 10-1 10-2 10-3 五组（对照）10-510-610-7表一：照射时间及梯度如下表所示牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。
细菌对牛奶的作用有一下几种：（1）产酸――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。
（2）产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。
（3）胨化――细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。
（4）酸凝固――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变化，当酸度很高时，可使牛奶凝固。
（5）凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。
（6）还原――细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因此石蕊还原褪色。
接种与观察结果：在试管培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反应。
1.2.5.3 VP试验有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸,再进一步将丙酮酸脱羟变为乙酰甲基甲醇,在碱性环境中被空气中的氧氧化为二乙酰,二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基发生反应生成红色的化合物。
接种与观察结果：在试管培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，按上述特征观察和记录颜色变化。
1.2.5.4柠檬酸盐试验有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解柠檬酸盐钠生成碳酸钠，是培养基呈碱性。
能利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌也能利用铵盐作为唯一氮源，铵盐被分解为氨而产生碱性。
柠檬酸盐培养基本身呈深绿色，若该菌能利用柠檬酸盐生长，则培养基变蓝色，否则仍为绿色。
接种与观察结果：在试管培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，按上述特征观察和记录颜色变化。
1.2.5.5淀粉试验有些细菌能产生淀粉酶（胞外酶）使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖。
淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
接种与观察结果：在平皿培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，在培养基上滴上碘液，按上述特征观察和记录颜色变化。
1.2.5.6葡萄糖发酵试验有的细菌分解某种糖会产生某种有机酸和气体，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色变为黄色，气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
实验中，葡萄糖培养基试管中，接种大肠杆菌和变形杆菌的试管内出现气泡且培养基变为黄色，对照组无气泡，培养基仍为紫色，说明大肠杆菌能分解葡萄糖产酸产气。