全程科研训练报告
在近两年的时间里，我从师于XX教授并在他的科研平台上学习和锻炼。
在老师和师兄师姐的指导与帮助下，我学会了许多实验方法，掌握了基本的实验技能，逐渐步入科学研究的正确轨道。
更重要的是，这段经历让我真正体会到了科研的严谨性以及科研工作者的辛苦与成果的来之不易。
下面我就学到的内容做个简要介绍：
一、引物设计
利用primer 5.0软件设计引物，根据目的基因和载体的具体要求调整引物序列，注意GC含量及Tm值等因素。
二、载体构建
原理：依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
步骤：1、目的片段的获取
从组织或细胞中提取基因组或提取RNA在进行反转录获得其cDNA，利用PCR技术扩增目的片段。
2、酶切目的片段及载体
使用单酶切或双酶切处理目的片段和载体，37℃放置3~6小时，或者减少酶量过夜酶切，之后，通过琼脂糖凝胶电泳回收所需片段。
注意控制酶量以防星星活性等不良反应，以及在酶切结束前30~50min加入CIAP防止片段自连。
3、连接
将酶切处理过的目的片段及载体通过T4DNA连接酶连接起来，根据目的片段和载体的浓度确定用量：载体物质的量/目的片段物质的量=1/3~10，即V目的片段/V载体=（3~10）*目的片段长度*载体浓度/载体长度*目的片段浓度。
置于16℃2~3小时，或者4℃过夜连接。
若为平末端，连接酶用量十倍以上。
4、转化
一般方法：取50ul感受态细胞于冰上融化后，加入50~100ng纯质粒或10~20ul连接产物，轻弹混匀冰浴30min，42℃热激90s立即冰浴2min，加1mlLB，置于37℃摇床上200rpm温育1h,4000rpm离心3min，留200ul打散涂板。
5、单克隆检测
5.1挑单克隆
预先在LB培养液中加入氨苄，混匀；取EP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加3~5ml上述培养液，然后用接种环（或白枪头）挑单克隆，之后将挑好的菌摇7~8小时，至混浊即可。
5.2单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液送测序。
三、细胞培养
依据实验需要并在师姐的指导下，我练习培养了F9和293细胞，掌握了细胞复苏、冻存、换液、传代、单克隆挑取的基本方法。
细胞培
养过程让我体会最深的就是一定要注意操作的无菌和温和。
1、细胞复苏
从液氮中取出细胞，迅速置于37℃融化，加1ml培养液混匀转入4ml 离心管再加1ml培养液，1000rpm*5min弃上清，加入1ml培养液吹打细胞，转入培养皿，摇匀37℃培养。
2、细胞冻存
配制冻存液：10%DMSO+90%血清
细胞消化，装于4ml离心管1000rpm*5min，弃上清，加1ml冻存液吹打混匀转入冻存管，用封口膜封口，外加棉花包裹，-4℃放置1~2小时再-70℃过夜，存入液氮。
四、转染
1、脂质体转染（lipo2000、HP）
提前按比例稀释脂质体和质粒，用无血清的的培养液洗两次细胞，再加一次无血清培养液，将稀释后的脂质体和质粒的混合物加入，摇匀，37℃放置6~24h，吸出无血清培养液，换入正常培养液继续培养。
2、电转
将细胞用无血清培养液转入电转杯中，加入待转质粒，混匀，将电转杯放入电转仪中，调整好电压和频率，开启电转开关，待电转杯中液体突然冒泡后完成，吸出置于含正常培养液的培养皿中37℃培养。
五、western-blotting
1、蛋白样品制备
收集待测细胞，加入loading buffer，100℃蛋白变性。
2、SDS-PAGE凝胶配制
根据蛋白分子质量大小和实验要求，配制相应浓度的分离胶和浓缩胶，注意梳子与胶之间不要留有气泡。
3、SDS-PAGE蛋白电泳
组装电泳仪，将蛋白样品和marker加入胶孔中，倒入蛋白电泳缓冲液，调整电压开始跑胶，注意浓缩胶和分离胶分别对应不同的电压。
4、转膜
使用硝酸纤维素膜，将其裁剪成略大于胶的形状，按顺序将滤纸-胶-膜-滤纸置于转膜板中，注意正负极的朝向，由于蛋白带负电，将负极置于靠近凝胶的一侧，加入转膜缓冲液即可开始跑胶（整个过程冰浴）。
5、曝光
严格避光，将曝光液加在转好的硝酸纤维素膜与相纸之间，用曝光板夹紧一定时间后取出定照并清洗。
六、cDNA的获取
1、Trizol法提取RNA
收细胞或研磨的组织，加Trizol，震荡，静置10min，将其转入1.5ml 离心管中，加1/5Trizol体积的氯仿，剧烈震荡，15~30℃*3min，分层。
冷冻离心12000rpm*10min，将上清转移到另一离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置30min，冷冻离心12000rpm*10min，吸出上清。
加75%乙醇洗RNA沉淀，7500rpm*2min,吸出液体，根据RNA沉淀的量，加适量的DEPC处理过的ddH2O溶
解RNA，并检测RNA浓度。
2、反转录PCR
使用Fermentas反转录试剂盒，按说明加样
37℃15min
85℃5s
得cDNA
七、免疫荧光
1、样品准备
对于贴壁细胞可用洁净的盖玻片进行固定，即待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行后续工作
2、固定
使用碧云天生产的免疫染色固定液（P0098），固定完毕后，可用免疫染色洗涤液（P0106）洗涤两次，每次5min
3、封闭
加入免疫染色封闭液（P0102），封闭60min，如果背景较高可以4℃封闭过夜，注意保湿
4、一抗孵育
参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（P0103）稀释一抗。
吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收一抗，洗涤三遍。
5、二抗孵育
适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液（P0108）稀释荧光标记的二抗，
吸尽洗涤液立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗，洗涤三次
6、蛋白检测
荧光显微镜下观察
以上就是我在全程科研训练中完成的主要实验，在这次训练过程中，我不仅补充了理论知识，更锻炼了动手操作能力，它将使我在今后的科研路上稳健前行。
除此之外，逐步培养起的科研兴趣和日渐形成的实验态度才是我这次全程训练最宝贵的收获。
在此，致谢给予我这次学习机会的老师以及帮助我的师兄师姐们！。