浙江省分析测试科技计划研究项目工作总结报告一、项目基本情况农业技术的进步极大地促进了农业生产的发展，可新的困扰随之而来，蓄积在蔬菜、粮食中的各种污染物对人体健康构成了严重威胁，在利用高技术手段大幅度增产的同时，人们也承受着高科技这把“双刃剑”所带来的负面压力。

联合国开发计划署1994年在人类发展报告上首次提出了人类安全的概念，并列出危及人类安全的7种类型，食品安全就是其中一种。

日益凸现的食品安全问题，与我国政府提出的树立“科学发展观”精神也严重相悖。

科学发展观十分注重“人”这一要素，强调以人为本。

在抓好经济增长促进可持续发展的同时，也要把诸如保证人的身心健康、延长人的预期寿命、提高人的生活质量等问题摆到重要位置。

食品安全就是关乎这些要求、关系国计民生的大问题。

食品安全工作任重道远。

2005年，我国针对食品安全就提出：以提高公众健康水平、增强中国食品产业的国际竞争力为目标，紧紧围绕净化产地环境、保证投入品质量、规范生产行为、强化监测预警、严格市场准入等关键环节，建立健全食品安全法律体系、监管体系、标准体系、科技支持体系等八大体系建设，政府、产业界、消费者、媒体、教育和科研机构等有关方密切配合、相互协作，确保食品安全。

随着近年来人们生活水平的日益提高和膳食结构的不断改善，对肉、蛋、乳、水产品等动物性食品的食用消费需求在不断增加，由于集约化的养殖与管理之间的不协调，造成了大量疫病的流行、暴发以及其他不利于动物健康的因素出现，因此大量的、种类繁多的兽药被应用于畜禽生产的许多环节。

磺胺类抗生素是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类抗生素的总称，包括磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶等。

常用于预防和治疗细菌性疾病，在兽医临床上应用广泛，因此在动物源性食品中多有残留。

经常食用含抗生素的食品，容易诱导菌株产生耐药性，导致人类过敏，会产生致癌、致畸、致突变作用，其中磺胺类抗生素还可引起泌尿系统的损害，造成对肾脏的损害，以及溶血性贫血、肝损害等。

我国农业部2002年发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定磺胺类药物的最高残留限量为100μg/l[1]。

奶制品残留的抗生素会使人被动地接受，并积累抗生素，对抗生素产生耐药性，患者用抗生素治疗时，效果下降。

有些“过敏”体质的人，长期饮用甚至会造成“休克”。

如经常饮用抗生素残留超标的牛乳会破坏人体的肠道菌群平衡。

牛乳中残留抗生素还会对人体产生直接或间接毒性。

而且实验证明，由于一般抗生素对热的稳定性高，牛奶加热杀菌无法将其破坏，实际收效并不明显。

因此混有抗生素牛奶的原料乳加工成消毒奶等乳制品后，仍有大部分抗生素残留。

我国于1990年在《乳与乳制品管埋办法》第四条明确规定：乳牛在应用抗生素期间和停药后5天内的牛乳不得食用。

2001年9月农业部发布的《无公害食品生鲜牛乳》行业标准中明确规定“抗生素不得检出”。

但这一规定有不够严谨之处，因为用精度为十万分之一或百万分之一级别的仪器检验含有千万分之五含量的抗生素残留，可能是检验不出来的。

但目前适合国情的检测国标方法，还没有做出明确规定。

目前我国食品安全检验检测体系目前存在的问题有检测点少；只能提供“快速不准确，准确不快速”的检测；技术力量薄弱；检验检测费用太高等问题。

因此，发展高灵敏度、高选择性、操作简便、方便实用的抗生素残留分析方法在食品安全检测中具有非常重要的意义。

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）利用样品溶液中的各组分在流动相与色谱柱(固定相)之间具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度即可被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

当与试样预处理技术相配合，高效液相色谱法可达到高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，从而能够分离复杂相体中的微量成分。

由于高效液相色谱法具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。

固相萃取(Solid-Phase Extraction 简称SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率、更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力。

可以广泛的应用在医药、食品、环保、商检、农药残留等领域。

因此本项目采用固相萃取-高效液相色谱法来对奶制品磺胺类抗生素残留进行分析测试研究。

二、项目执行情况本项目使用的分析仪器设备有：日本岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪（配置C18色谱柱），日本岛津SPD-10A紫外检测器，上海安谱盖式多歧管装置等。

乳制品种类繁多，本课题主要针对酸奶类饮料及奶粉进行检测分析。

磺胺类抗生素种类包括磺胺异恶唑、磺胺密啶、磺胺甲恶唑、柳氮磺胺比定、甲氧卞定等数十种，本课题主要对应用最广的几种磺胺类抗生素进行检测。

实验前期，要完成对流动相的选择，并确定最佳波长，以建立最佳的高效液相色谱分析条件。

本课题对不同流动相如甲醇:乙腈=50:50、乙腈:水=70:30、乙腈:水:乙酸=40:49:1、甲醇:0.08%乙酸=50:50、甲醇:0.08%乙酸=40:60、甲醇:0.08%乙酸=20:80、甲醇:0.08%乙酸=45:55、甲醇:0.08%乙酸=60:40等进行实验，发现选用甲醇:0.08%乙酸=45:55或甲醇:0.08%乙酸=40:60作流动相时，峰形理想，分离效果好，且出峰时间短，因此选择甲醇:0.08%乙酸=40:60或甲醇:0.08%乙酸=45:55为流动相。

同时对不同波长λ=230、250、260、263、272、275、280、290nm条件下进行检测，发现在263nm或272nm时有较好吸收。

图1为对其中两种磺胺类抗生素：磺胺嘧啶(SDZ)及磺胺甲噁唑(SMX)在以甲醇：0.08%乙酸=40：60为流动相；检测波长272nm；流速0.8mL/min条件下进行检测时所得谱图。

图1 SDZ和SMX标准品的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution of SDZ and SMX(2.899min- SDZ, 4.813min-SMX)要对实际样品进行测定，则得到的方法应能进行定量测定，而不能只限于定性分析，本课题采用标准曲线法以实现定量测定，标准曲线法也称为外标法或直接比较法，这是在色谱定量分析中，特别是HPLC定量分析中比较常用的方法，是一种简便、快速的绝对定量方法。

首先用标准溶液（要进行定量分析时必须要使用标准进行对比）配制成不同浓度的标准系列，在与预测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对标准溶液浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。

若不通过原点，说明测定方法存在系统误差。

标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。

此方法的优点是:绘制好标准工作曲线后，计算时可直接从标准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。

基本公式如下：%100×=i i i K A ω （1）%100×=L i i K h ω （2）式中： i ω——样品中组分i 的含量;，——样品中组分i 的峰面积或峰高;i A i h ——单位峰面积或峰高的校正因子。

L i K K ，在如图1所示的色谱条件下，得到的磺胺嘧啶标准曲线如图2所示：图2最佳色谱条件下SDZ 的标准曲线Fig.2 The Standard Curve of SDZ in the best chromatogram condition 标准曲线方程为y=0.0005x-0.0901,相关系数R 2=0.9993。

结果表明在0.05～1μg/ml的范围内呈良好线性关系。

在如图1所示的色谱条件下，得到的磺胺甲噁唑标准曲线如图3所示：图3最佳色谱条件下SMX的标准曲线Fig.3 The Standard Curve of SMX in the best chromatogram condition标准曲线方程为y=0.00002x-0.0025,相关系数R2=0.9994，结果表明在0.05～1μg/ml的范围内呈良好线性关系。

通过采用在空白样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率实验，测得磺胺类抗生素的平均回收率达到97%左右。

乳制品所含物质种类较多，某些物质可能会对色谱分析产生干扰，因此本项目通过固相萃取法对乳制品进行预处理，以消除干扰，本项目研究了采用正已烷、醋酸-醋酸钠缓冲液、乙腈、乙酸铵、甲醇及水作为淋洗及洗脱液对固相萃取效果的影响，同时研究了前期处理对实验结果的影响，得到对样品较好的处理方式：称取一定量某品牌奶粉，加水溶解，加入亚铁氰化钾溶液（0.25mol/l）和醋酸锌溶液（1 mol/l ）后，去除上层脂肪，离心处理。

取离心上层清液，过活化的固相萃取柱（事先用3ml甲醇及3ml蒸馏水进行活化），然后用10ml蒸馏水淋洗萃取柱，最后用5ml甲醇对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，用流动相溶解，过0.45μm滤膜。

通过固相萃取可以大大提高检测物的富集率，提高检测的准确性。

通过对不同流动相、不同波长色谱条件的实验研究，及对不同的奶制品进行分析，建立的固相萃取-高效液相色谱法，具有高效、分析时间短、检出限达微克级别、操作简单等特点。

对同一样品，通过连续进样测定，结果表明方法的精密度良好，同时也具有良好的重复性。

在固相萃取处理过程中，分别采用正已烷、醋酸-醋酸钠缓冲液、乙腈、乙酸铵、甲醇及水作为淋洗及洗脱液进行实验，通过对回收率的测定比较，用甲醇及水作为淋洗及洗脱液效果较好。

对某酸奶饮料的两种磺胺类抗生素（SDZ和SMX）含量进行检测，结果如表1。

表1 样品测定结果，%，n=6Tab 1 Results of sample assay, %, n=6A1 A2 A3 均值SDZ含量(mg/l)0.380.330.410.37SMX含量(mg/l)0.240.270.250.25 RSD/%0.47对某品牌奶粉进行检测，未见有两种磺胺类抗生素（SDZ和SMX）被检出。

本项目采用的固相萃取-高效液相色谱法与其他方法如示波极谱法、荧光光度法、毛细管电泳法等相比，重复性良好，灵敏度高，对磺胺类抗生素残留的检出限可达0.05～1μg/ml，此方法简便、快速，可供生产企业控制产品质量，检测单位分析测试实际使用。