PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
21 .
常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
20 .
常见荧光素： A. FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm B. PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm C. PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm D. PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm E. APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
2.
流式细胞仪
BD FACSVantage
BD Calibur
Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪
BECKMAN CytoFLEX
3.
Miltenyi MACSQuant
流式细胞仪的组成
Fluidics
Waste
Optics
Electronics
Software
4.
进样准备
样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
.
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. ▪X-Axis: 荧光信号强度. ▪Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
Side Scatter
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
荧光信号
488nm excitation
~520nm emission
FITC-labeled antibody binds surface antigen
.
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
8.
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run
2千—1万 cells/Test
.
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
.
Scatter – How it works
Laser Light
Laser Light
Laser Light
.
SSC 粒细胞 FSC
SSC 单核细胞 FSC
SSC 淋巴细胞 FSC
流式细胞技术
FLOW CYTOMETRY
王丽
2015-07-07
What does it mean?
CYTOMETRY
Cell Measure(ment)
MEASUREMENT OF A CELL
FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM) – 流式细胞仪 Flow Sorter – 流式细胞分选仪
11 .
软件系统
12 .
InCyte 开放模块- Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
13 .
R1
拖曳式设门，操
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
Work Station
Min/Max threshold
Heat-Map数据 分析直观化
测量参数
光散射强度 荧光强度 样本体积 细胞数目
5.
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
6.
FluorescentlyFra bibliotekLabelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
10 .
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管 功能: 1) 量化电压脉冲 2) 将模型信号转换 成数字信号 3) 荧光补偿 4) 数据传给电脑以 便分析
Longpass
Shortpass
Bandpass
460 500 540
460 500 540
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
LP 500 = >500 nm SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
9.
easyCyte 5HT system
.
前向散射角和侧向散射角
侧向散射角
虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。
前向散射角
Incident laser light
“大小” 成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 • 细胞形状
FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片