3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪 3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪
流式细胞仪 (flowcytometry ， FCM) 是一种多用途 的精密分析仪器，应用派若宁、吖啶橙、 的精密分析仪器 ， 应用派若宁 、 吖啶橙 、 噻唑橙等这 结合， 些特殊的荧光染料与Ret中的RNA结合，当FCM 发出 的激光照射于细胞上时， 的激光照射于细胞上时 ， 根据细胞能否发射出特定颜 色的荧光， 色的荧光 ，通过单参数定量测定RNA，从而精确测定 Ret占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射出 占成熟红细胞的比率。 的荧光强度，或光吸收量大小、 的荧光强度 ， 或光吸收量大小 、 光散射量多少等参数 成熟程度进行分群， 的比例关系对Ret成熟程度进行分群，将其划分为低荧 光 强 度 网 织 红 细 胞 (LFR) 、 中 荧 光 强 度 网 织 红 细 胞 (MFR)、高荧光强度网织红细胞(HFR)。
传统的显微镜计数方法操作较繁 影响结果的因素较多。 近年来， 琐 、 影响结果的因素较多 。 近年来 ， 国内开始使用国际血液学标准化委员 (ICSH)推荐的 推荐的Miller窥盘进行计数 窥盘进行计数， 会(ICSH)推荐的Miller窥盘进行计数， 规范了计算区域， 减少了实验误差， 规范了计算区域 ， 减少了实验误差 ， 使结果准确性有所提高( 使结果准确性有所提高 (卫生部临检中 心建议，CV控制在 控制在15 之内) 心建议 ， CV控制在 15 %之内 )。 Miller 窥盘法是将一种光学圆片状Miller窥盘 窥盘法是将一种光学圆片状Miller窥盘 安放在显微镜目镜中， 安放在显微镜目镜中 ， 窥盘中有面积 比例为1 个正方形计数方格， 比例为 1： 9的 2个正方形计数方格 ， 只 需计数1 需计数 1 ／ 9 小方格内的红细胞即可准 确估量出整个大方格内的红细胞数量。 确估量出整个大方格内的红细胞数量 。
1.手工法 1.手工法
陈高远则在这两种窥盘的 基础上设计了改良式Miller 基础上设计了改良式 Miller 窥 采用双正方形结构， 盘 ， 采用双正方形结构 ， 小方 格和大方格之比也达到1 10， 格和大方格之比也达到1：10， 只是将红细胞计数区域位移至 中心部位， 中心部位 ， 以方便红细胞数量 的计数。 的计数。
1.手工法 1.手工法
刘志贤设计了一种新的Ret 计数 刘志贤设计了一种新的 Ret计数 窥盘即180× 扇形Ret 计数窥盘 计数窥盘： 窥盘即 180×4 扇形 Ret计数窥盘 ： 圆 形直径为19 mm，圆心角∠ AOB=∠ 形直径为19 mm，圆心角∠ AOB=∠ COD=∠EOF=∠ GOH=180 。 COD=∠EOF= ∠ GOH=180。 弧 AB =CD=EF=GH=180。计算公式为： =CD=EF=GH=180。计算公式为：R et %=整个计数区域内的Ret数／(4个 整个计数区域内的Ret数 扇面 总数 小 扇面 区 域 内的 RBC 总 数 ×5)×100 这种新型Ret 计数窥盘 计数窥盘4 ％ 。 这种新型 Ret计数窥盘 4 个扇形 区域均匀分布在整个视野的4 个方向， 区域均匀分布在整个视野的 4 个方向 ， 4个扇形面积之和是整个圆形面积的1 个扇形面积之和是整个圆形面积的1 ／ 5 ， 因此在理论上基本解决了红细 胞分布不均匀引起的问题， 胞分布不均匀引起的问题，降低了系 统误差和随机误差 。
1.手工法 1.手工法
国内很多学者在此基础上设计 了几种改良的Ret 计数窥盘 计数窥盘。 了几种改良的 Ret计数窥盘 。 张时 民等设计了一种双环式结构的Ret 民等设计了一种双环式结构的 Ret 计数窥盘， 计数窥盘，该盘的特点是小圆环和 大圆环面积之比为1 10， 大圆环面积之比为 1 ： 10 ， 小圆环 为计数红细胞数量， 为计数红细胞数量，大圆环为计数 Ret数量 Ret 数量 。 其圆形结构更加适合于 数量。 人们观察和计数显微镜下细胞数量 的习惯， 的习惯，而且此比例更加易于计算 红细胞和Ret的比值 红细胞和Ret的比值。 的比值。
概述
红细胞在骨髓中生成， 至发育为成熟红细胞， 红细胞在骨髓中生成 ， 至发育为成熟红细胞 ， 经 历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、 历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、 中 幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞， 幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟 红细胞。随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低 含量逐渐减低， 红细胞。随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低，至细胞 完全成熟后消失或接近消失， 完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越 表示细胞越幼稚。ICSH将Ret分为 分为4 多，表示细胞越幼稚。ICSH将Ret分为4型：Ⅰ型（丝球 花冠型或网型） 破网型） 型）、Ⅱ型（花冠型或网型）、Ⅲ型（破网型）、Ⅳ 型 颗粒型） 正常生理状态下， 型只存在于骨髓， （颗粒型）。正常生理状态下，Ⅰ型只存在于骨髓， Ⅱ 型在外周血也很难见到， 型仅有少量释放到外周血， 型在外周血也很难见到，Ⅲ型仅有少量释放到外周血 ， 因此外周血网织红细胞计数时以Ⅳ型为主。 因此外周血网织红细胞计数时以Ⅳ型为主。
网织红细胞检测进展及其临床 应用
概述
网织红细胞(reticulocyte ， Ret)是介于晚幼 网织红细胞 (reticulocyte， Ret) 是介于晚幼 红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞， 红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略大 于成熟红细胞。 于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚失 去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞， 去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，浆内尚 残留有嗜碱性RNA，经碱性染料（如天青B 残留有嗜碱性RNA，经碱性染料（如天青B、煌 焦油蓝或新亚甲蓝）活体染色后， 焦油蓝或新亚甲蓝）活体染色后，在包体内可见 蓝色点状或网状结构，故名网织红细胞。 蓝色点状或网状结构，故名网织红细胞。
1Байду номын сангаас手工法 1.手工法
卫生部临床检验中心控制Ret计数CV≤15%需镜检的RBC数目 卫生部临床检验中心控制Ret计数CV≤15%需镜检的RBC数目 Ret(%) 1-2 3- 5 >6 计数Miller窥盘小方 计数Miller窥盘小方 格RBC 444 222 111 相当于缩视野法计数 RBC数目 RBC数目 4000 2000 1000
中性红
2.血细胞分析仪法 2.血细胞分析仪法
1993年以来 可进行Ret 计数的血细胞分 1993 年以来 ， 可进行 Ret计数的血细胞分 年以来， 析仪相继问世，因其具有重复性好、准确度高、 析仪相继问世，因其具有重复性好、准确度高、 省时等优点，正被越来越多的医院所采用。 省时等优点，正被越来越多的医院所采用。仪 器法Ret 计数使用各种荧光染料和非荧光染料 器法 Ret计数使用各种荧光染料和非荧光染料 Ret进行染色 进行染色， 对 Ret 进行染色 ， 采用鞘流技术和射频技术等 不同原理进行检测。 不同原理进行检测。血细胞计数仪不仅可以计 数 Ret ， 同 时 还 能 检 测 出 网 织 红 细 胞 绝 对 值 Ret#、网织红细胞平均体积(MRV)、 Ret#、网织红细胞平均体积(MRV)、网织红细 胞成熟指数(RMI)等许多参数 这些参数是Ret 等许多参数， 胞成熟指数(RMI)等许多参数，这些参数是Ret 分析、临床应用和研究的热门领域。 分析、临床应用和研究的热门领域。
2.血细胞分析仪法 2.血细胞分析仪法
统计表明， 仪器法测定Ret 精密 统计表明 ， 仪器法测定 Ret精密 度有明显提高： 对低Ret 标本 CV值 标本， 度有明显提高 ： 对低 Ret标本 ， CV 值 10% 之间； 在 10% ～ 21 % 之间 ； 对正常范围的标 值在3 之间； 本，C V值在3 %～16 %之间；高值标 值在2 之间。 本，C V值在2 %～10 %之间。
Ret是红细胞成熟过程中的一个重要阶段 Ret是红细胞成熟过程中的一个重要阶段， 是红细胞成熟过程中的一个重要阶段， 是判断骨髓红系造血情况和疗效观察的重要指 其检测方法既有传统的显微镜目测法， 标 。 其检测方法既有传统的显微镜目测法 ， 又 有现代化的仪器计数法(如流式细胞仪、 有现代化的仪器计数法 (如流式细胞仪 、 网织红 细胞计数仪及血细胞分析仪) 现对Ret的检测进 细胞计数仪及血细胞分析仪)。现对Ret的检测进 展 ， 各检测方法的优缺点及其在临床上的应用 逐一讲述。 逐一讲述。
概述
网织红细胞检测进展
1.手工法 1.手工法 2.血细胞分析仪法 2.血细胞分析仪法 3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪 3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪
1.手工法 1.手工法
手工法分玻片法和试管法。 手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使 混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短， 混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果 偏低；试管法容易掌握，重复性较好， 偏低；试管法容易掌握，重复性较好，必要时还可 以从混合血液中再取标本重新涂片复查。 以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法被 列为手工法Ret计数的参考方法 按卫生部《 计数的参考方法。 列为手工法 Ret计数的参考方法。 按卫生部 《 全国 临床检验操作规程》 临床检验操作规程 》第 2版 ， 采用试管法用煌焦油 蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片， 蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片，选 择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处， 择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处，每份 Ret>6 标本油镜下参照陈宝梁的建议 ，即Ret>6 %，计数 红细胞1000 个 计数红细胞2000 个 红细胞 1000个 ； 3% ～ 5 % 计数红细胞 2000个 ； 1 %～2% 应计数红细胞4000个；小于1 %计数红细胞 应计数红细胞4000个 小于1 10000个 10000个。
手工法网织红细胞活体染色染料评价
染料 评价
WHO推荐使用，对RNA着色强，试剂稳定， WHO推荐使用，对RNA着色强，试剂稳定， 新亚甲蓝 Hb几乎不着色 Hb几乎不着色