《生物工程进展》1999,V ol.19,No.5综 述昆虫抗菌肽研究现状 陈留存 王金星(山东大学生命科学学院生物系 济南 250100)摘要 近年来鉴定了的化学结构的昆虫抗菌肽的数目有迅速上升的趋势,一些新型昆虫抗菌肽相继被分离纯化。
不同结构的抗菌肽其抗菌特性及其抗菌谱存在着巨大差异,抗菌机制也不同。
昆虫免疫与动物免疫机制既存在着区别也存在着某些相似性。
关键词 昆虫免疫 抗菌肽 天蚕素 防御素1 引言昆虫抗菌肽是昆虫血淋巴中产生的一类小分子肽,当昆虫受到外界微生物的刺激时,可大量迅速地合成。
它具有热稳定性强,强碱性,抗菌谱广的特点,可以抗革兰氏阳性菌,也可以抗革兰氏阴性菌,有些甚至对病毒和肿瘤细胞均具有抗性[1]。
因此,自从1980年Baman发现第一种抗菌肽——天蚕素(cecropin)以来,许多昆虫抗菌肽相继被分离、纯化,氨基酸一级结构被确定,有些抗菌肽的基因结构也已确定。
但80年代人们主要集中研究鳞翅目、鞘翅目等大型经济昆虫,进入90年代以来,除继续研究大型昆虫外,一些小型种类日益引起有关学者的重视,如双翅目、膜翅目、同翅目等,而且除昆虫外,在其他许多无脊椎和某些脊椎动物中也发现了抗菌肽。
因此抗菌肽逐渐成为昆虫免疫学及分子生物学的研究热点之一。
一些昆虫抗菌肽已有专文论述[2,3],但关于抗菌肽的分类及抗菌机制却很少涉及,本文结合近年来新发现的昆虫抗菌肽,就其结构、性质及抗菌机制分类作一介绍。
2 昆虫抗菌肽的类型迄今为止,仅在昆虫中发现的抗菌肽已达100多种[4],根据结构及功能的不同可以分为4类,即天蚕素类(cecropins),昆虫防御素(insect defensins),富含脯氨酸(Pro)的抗菌肽(proline-rich peptides),富含甘氨酸(Gly)的抗菌肽(gly sine-rich piptides)。
2.1 天蚕素类(Cecropins)天蚕素是最早发现的抗菌肽。
1980年, Bom an等成功地把天蚕素与天蚕的溶菌酶在生化性质及功能上区分开,同年分离到纯的天蚕素A和B。
1981年,Boman与Bennic合作测定了天蚕素A和B的一级结构,随后在柞蚕、肉蝇、烟草天蛾中都发现了天蚕素或类似天蚕素的抗菌肽。
由表1可以看出,这类抗菌肽分子结构相似,都有31-39个氨基酸残基组成,分子量4kD左右,半胱氨酸(Cys)含量少,不能形成分子内二硫键,有强碱性的N端和缩水性强的C端,在肽的许多特定位置有较保守的残基,如2位的色氨酸(T ry),5、8、9位具1个或1对赖氨酸(Lys),11位具天冬氨酸(Asn),12位具精氨酸(A rg),有些位置尽管残基不同,但仍是保守替换。
1988年,Halak等人利用二维核磁共振技术测定天蚕素A的三级结构,其分子结构含有两段 -螺旋,N端1-4位4个氨基酸是非螺旋化的,5-21位为第一个 -螺旋,该螺旋中极性与非极性氨基酸含量相当,因此该螺旋对水和脂都具有亲和性,称为双亲的 -螺旋,22-2455表1 几种天蚕素的一级结构抗菌肽氨 基 酸 序 列天蚕素D W_NPFKEL E KVGQRVRDA VISAGPAVAT VAQATALAK*柞蚕素D W_NPFKEL E RVGQRVRDA IISAGPAVAT VAQATALAK*烟草天蛾B2W_NPFKEL E RVGQRVRDA VISAAPAVAT VGQAAAIAR*天蚕素A KW_KLFKKI E KVGQNIRDG IIKAGPAIAV VGQAT QIAK*天蚕素B KW_KVFKKI E KM GRNIRNG IVKAGPAVAV LGE AKAL*家蚕抗菌肽CM IV RW_KIFKKI E KVGQNIRDG IVKAGPAVAV VGQAAT I*家蚕杀菌肽B RW_KIFKKI E KM GRNIRDG IVKAGPAIEV LGS AKAI*果蝇杀菌肽A GWLKKIGKKI E RVGQHT RDA T I_QGLGIAQ QAANVAATAR*肉蝇毒素IA GWLKKIGKKI E RVGQHT RDA T I_QGLGIAQ QAANVAATAR*猪杀菌肽Cecp SW LSKT AKKL E NSAK-KR_—ISEGIAIAI QGG__PR *表示C端酰胺化,黑体表示保守氨基酸位为A la-Gly-Pro形成的结节部,25-37位为第二个 -螺旋,其中疏水氨基酸含量高,故该 -螺旋疏水性强,由此可知,由于昆虫天蚕素多肽链中含有一个保守的Pro,因而在两段 -螺旋之间出现一个结节部,这种结节部在其他一些细胞膜毒素如melitin,alamethicin,pardax in中普遍存在,而且这种结构与天蚕素的抗菌活性密切相关。
从表1还可以看出,所有昆虫抗菌肽的C端都是酰胺化的,C端的酰胺化对其广谱抗菌极为重要[5]。
天蚕素类抗菌肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较高抗性。
昆虫天蚕素对细菌的作用过程可概括如下:首先在静电作用下,带正电荷的天蚕素分子与带负电的细菌细胞表面结合,使许多天蚕素分子聚集于细菌细胞外膜上。
然后,疏水的C端 -螺旋插入疏水的细菌细胞膜中央,双亲的 -螺旋留在膜表面。
完成该步过程的关键在于两股 -螺旋之间存在一个结节部,增加了整个分子的柔韧性。
最后,由于大量天蚕素分子与细胞膜结合,使得膜外正电荷增多,两侧膜电位升高,超过阈值时导致膜去极化,进而双亲的 -螺旋插入膜中,两个或多个分子聚集在一起形成离子通道,导致细胞内阳离子大量外流,细胞内ATP合成速度下降,细胞呼吸受到抑制,最后菌体停止生长或死亡。
实验表明,当脂质体中含有胆固醇时,天蚕素对其作用明显降低,而胆固醇是真核细胞细胞膜的固有成分,这可能是天蚕素只作用于原核生物的重要原因[6]。
1989年,Lee等从猪的小肠中分离到一种类似天蚕抗菌素的抗菌肽,命名为Cecp (cecropinP1),其氨基酸的序列与天蚕素B具有33%的同源性,二维核磁共振分析表明,其空间结构主要为一条纵贯全长的 -螺旋,昆虫天蚕素中保守的Pro在Cecp中不存在,因此Cecp中不存在结节部。
另外,Cecp的C端为羧基而不是酰胺基。
Cecp对革兰氏阳性菌的抗性与昆虫天蚕素相当,而对革兰氏阴性菌抗性较弱,其抗菌机制也与后者不同。
首先,Cecp分子中的碱性氨基酸与细菌外膜表面的带负电的磷脂酰头部结合,使得大量CecP单体结合在细菌外膜上,形成“地毯式”的一层,然后由于分子的旋转导致Cecp的疏水残基与膜中央的疏水区域结合,超过阈值时,则在质膜上形成瞬时的小孔,进而使质膜瓦解,菌体死亡[7]。
2.2 昆虫防御素(insect defensins)昆虫防御素一词来源于这些肽与哺乳动物嗜中性白细胞中分离到的防御素具极大的相似性。
第一种昆虫防御素由M asturyam a于1988年在一种半翅目昆虫肉蝇(Sar co p haga p eregr ina)中发现。
迄今为止仅在昆虫纲中就有15大类,30多种防御素被报导。
这些昆虫包括双56翅目5种、鞘翅目2种、膜翅目1种、毛翅目1种、半翅目1种、蜻蜓目1种,而且在蛛形纲的一种蝎子(L eiurus quinquestriatus)和软体动物的贻贝(M y tilus edulis)中也发现了防御素[8]。
但在鳞翅目昆虫中尚未发现防御素。
表2 几种昆虫防御素的一级结构昆虫种抗菌肽氨基酸序列LOOP 螺旋 折叠绿蝇防御素A AT CDLL----SGTGINHSACAAHC LLRGNR- -GGYCNG_-KGVC VCRN尾蛆蝇防御素AT CDLL----SGTGINHSACAAHC LLRGGR- -GGYCNR--_KGVCVCRN肉蝇肉蝇肽A AT CDLL----SGTGINHSACAAHC LLRGNR- -GGYCNG----KAVCVCRN意蜂Royalis in VT CDLL---SFKGQVNDSACA ANCLSGKA-- -GGHCE-----KGVCICRKTS FKDLW DKYF 粉蛱防御素A FTC DVLGFEIAGT KLNS AACGAHC LALGRR--GGYCNS_--KS VCVCR肉蝇肉蝇肽B LT CEIDRS----------- -CLL HCRLKGYLRA-YC SQQ-----KVCRCVQ 由表2可知大多数昆虫防御素分子量为4kD左右,由38--43个氨基酸残基组成。
但有两个例外,一种是肉蝇肽(Sapecin B),仅由34个氨基酸残基组成。
另一种是从膜翅目昆虫意大利蜂(Ap is mellif era)中得到royalisin,由51个氨基酸残基组成[9]。
昆虫防御素都带有一个净正电荷,氨基酸序列中都含有6个Sys,且这6个Cy s的位置很保守,能形成3个分子内二硫键。
绿蝇防御素(Phorm ia defensin)是研究得最清楚的防御素,该分子由三个结构域组成:一个柔韧的N端环(loo p),一个亲水脂的 -螺旋中心,一个带有拟 转角的反向平行的 片层的C末端, -螺旋通过两个二硫键与 -片层的一条链稳定相连,而N端环通过第三个二硫键与 片层的另一条链相连。
不同种类昆虫防御素分子结构具有很大的同源性,其主要差异在于N端的环的大小。
而且Cy s-Xaa-Xaa-Xaa-Cys或Cys-Xaa-Cys(Xaa代表任意氨基酸)这种结构普遍存在,使 -螺旋通过分子内二硫键得以稳定[10]。
昆虫防御素可以抗革兰氏阳性菌而对革兰氏阴性菌几乎无作用,与哺乳动物防御素不同,昆虫防御素对真菌及真核细胞不起作用,其作用机制可以概括为:首先防御素分子依靠其双亲的 -螺旋与细菌外膜结合,散布于膜表面。
当大量防御素分子与膜结合后,它们聚合在一起形成寡聚体,这些寡聚体在细菌细胞上围成一个离子通道,从而细胞内K+大量外流,细胞内AT P合成下降,细胞呼吸受阻,菌体死亡。
实验证明,防御素分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要,如果用二硫苏糖醇(可以还原二硫键)处理昆虫防御素,则其抗菌活性丧失。
另外,增加介质的离子强度或降低温度也可以阻止离子通道的形成,从而使防御素的抗菌活性下降。
2.3 富含脯氨酸的抗菌肽(Pro line-rich peptides)这是八十年代末才发现的一类新型的昆虫抗菌肽。
1989年,Casteels等从膜翅目的意大利蜂(A.mellif era)中首先发现,后来这类抗菌肽又陆续被报导,如来自蜜蜂的apidaecin和abaecin,来自果蝇的drosocin,来自红蝽的pyr rho cor icin和metalniko nins等。
这类抗菌肽都由15--34个氨基酸残基组成,其中Pro含量在25%以上。