·综述与专论·生物技术通报BIOTECHNOLOGYBULLETIN2011年第3期海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在食品保鲜中的应用宫晓静1，2吴燕燕1（1中国水产科学研究院南海水产研究所，广州510300；2上海海洋大学，上海201306）摘要：海洋无脊椎动物抗菌肽抑菌广谱，稳定性高，且对生物体本身无害，其应用日益引起大量研究者的关注。综述了抗菌肽的几种类型、抑菌机理，介绍了海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展、存在的问题并分析其在食品保鲜中的应用前景。关键词：海洋无脊椎动物抗菌肽抑菌机理结构活性食品保鲜ReviewonResearchProgressesandApplicationintheFoodPreservationofAntimicrobialPeptidesfromMarineInvertebratesGongXiaojing1，2WuYanyan1（1SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Guangzhou510300；2ShanghaiOceanUniversity，Shanghai，201306）Abstract：Antimicrobialpeptidesfrommarineinvertebratesarewidebacteriostatic，highstabilityandharmlesstoorganism．Sotheirapplicationshaveattractedlargeresearchers’attentiondaybyday．Reviewsontheseveraltypes，mechanismofantimicrobial，theupdatedresearchprogress，actualproblemsandtheapplicationinthefoodofantimicrobialpeptidesfrommarineinvertebrateswereelu-cidated．Keywords：AntimicrobialpeptidesfrommarineinvertebratesBacteriostaticmechanismStructureActivityFoodpreservation

收稿日期：2010-09-14基金项目：海南省重点科技项目计划项目（070121，ZDXM20100005）作者简介：宫晓静，女，硕士研究生，研究方向：海洋生物资源利用；E-mail：xiaojinggong@163．com通讯作者：吴燕燕，女，研究员，研究方向：水产品加工与质量安全；E-mail：wyy1028@tom．com抗菌肽（antimicrobialpeptides，AMPs）是一类抗菌活性肽的总称。自1980年瑞典科学家Boman等［1］首次在美国天蚕蛹中分离出第一种特殊抗菌活性肽天蚕素（cecropin）以来，到目前为止，已经鉴定的抗菌肽达1000种以上，并且数量还在持续迅猛增长，最新数据可到国际上最权威的抗菌肽数据库（http：//www．bbcm．univ．trieste．it/～tossi）查询。从天然产物中获得抗菌肽并应用于工业，特别是食品保鲜防腐方面的研究是目前国内外的研究热点。海洋生物种类高达300－500×106［2］，其中海洋大型动物种类有0.5－10×106［3］。海洋无脊椎动物，由于其单独依靠体内免疫机制抵抗入侵细菌或病原体，因此內源性抗菌肽丰富，成为开发天然抗菌肽的重要资源。1抗菌肽的分类大多数抗菌肽是小分子短肽（≤10kD），其三维结构可用普通的二维核磁共振法获得。根据抗菌肽的核磁共振结构及其氨基酸序列，可将抗菌肽分为5类。1.1α-螺旋抗菌肽在海洋无脊椎动物抗菌肽中，这类分子的典型代表是Clavanins，是1997年Lee等［4］从柄海鞘（Styelaclava）的血细胞中分离得到的，含有一或两个α-螺旋结构，无半胱氨酸残基，具有高效的抗菌活性，但对哺乳动物无细胞毒性。1.2富含半胱氨酸的抗菌肽大多数海洋无脊椎动物防御素都富含半胱氨酸，形成一个或多个分子内二硫桥。例如，从贻贝Mytilus生物技术通报BiotechnologyBulletin2011年第3期edulis中分离得到的防御素（MGD），包含8个半胱氨酸，形成4个分子内二硫桥，二硫桥的位置是C4－C25、C10－C33、C14－C35和C21－C38［5］。1.3β-折叠抗菌肽鲎素（tachyplesins）和美洲鲎素II（polyphemusinII）属于β-折叠抗菌肽，是由20个氨基酸残基组成，分子内形成一个单一的β-发卡结构，并包含1或2个二硫键［6］。1.4不规则氨基酸组成的抗菌肽有些抗菌肽富含一个或多个特殊氨基酸，这些抗菌肽的结构构象与规则的α-螺旋或β-折叠不同，呈现无规则卷曲结构。例如，从凡纳对虾血细胞中分离的对虾肽Penaeidins富含脯氨酸，核磁共振结构研究发现，对虾肽中脯氨酸无规则排列，形成一个无规则的卷曲结构［7］。1.5含稀有修饰性氨基酸的抗菌肽少数由稀有修饰性氨基酸组成的抗菌肽在海洋无脊椎动物中异常罕见，大多是从细菌中分离得到的。deVos等［8］从乳酸乳球菌中分离的乳酸链球菌肽（nisin）就是这种抗菌肽，由稀有修饰性氨基酸羊毛硫氨酸、3-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸组成。该类抗菌肽抑制G+菌，由于经过翻译后修饰，导致它们没有确定的结构构象。2抗菌肽的抑菌机理有关抗菌肽的抑菌机理表明，抗菌肽存在多种抑菌模式，但其共同点是抗菌肽只有接近或接触细胞膜时才具有抑菌功效。一般认为，抗菌肽的两亲性螺旋结构与细胞膜上的磷脂头簇电荷相互作用，有选择性的破裂细胞膜，使靶细胞内容物外泄致死，或进入靶细胞内部，阻止蛋白质合成而致死靶细胞，从而达到抗菌的作用。抗菌肽与细胞膜作用主要采用两种模式：第一种是“桶木”模式［9］，抗菌肽的两亲性α-螺旋簇作用细胞膜，形成跨膜渠道，它们的疏水表面与膜类脂中心作用，而亲水表面插入内部形成水孔；第二种是“地毯”模式［10］，抗菌肽首先插入靶细胞膜表面，然后以毯式法覆盖靶目标，高浓度的抗菌肽与膜外磷脂头簇作用而导致膜渗透。对于G+菌，抗菌肽结合膜表面肽聚糖层而穿透质膜。而对于G－菌，则与外膜上的带负电脂多糖相互作用而破坏外膜。一般情况下，免疫反应后仍会有一部分抗菌肽继续留在细胞内，以防止病原体的复生或杀死残留病原体，抗菌肽的作用机制，让细菌很难产生抗性，这对于开发新型抗菌肽防腐剂很重要。3海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展3.1甲壳动物抗菌肽甲壳动物抗菌肽主要存在于血细胞中。1972年，Stewart等［11］发现鳌龙虾的血浆具有抑菌活性；1978年，Mori等［12］发现鳌龙虾的肝胰腺具有同样的抑菌活性。依据这些发现，White等［13］推测甲壳动物血液中致病微生物的控制受血细胞介导。10年后，Destoumieux等［14］证实这一推测，他们从凡纳对虾（Penaeusvannamei）血细胞中分离出对虾肽Penaeidins（Pen-1、Pen-2和Pen-3），其氨基酸残基为19－21个，分子量为5.48－6.62kD，N端富含脯氨酸，C端是一个含3个分子内二硫键的稳定结构域［7］。对虾肽对G+菌有强烈的抑制作用，而对G－菌的抑制性较弱，并具有广谱抗真菌活性［15］。Cuth-bertson等［16］从白滨对虾血细胞中化学合成了Pen-4，除具有Pen-1、-2、-3的性质外，其自身还有独特的活性，即抑制G+菌的高效专一性。Margherita等［17］从大西洋对虾Litopenaeusschmitti和Farfantepenaeuspaulensis的血清cDNA文库克隆出5种对虾肽，其结构分别类似于Pen-2、-4。近几年，关于Penaeidins结构及功能的研究多不胜数，具体信息可到PEN-base查询。Schnapp等［18］从岸蟹（Carcinusmaenas）中分离出富含脯氨酸的抗菌肽，分子量为6.5kD，序列与Bactenecin-7大致相似，具有广谱抗菌性。Relf等［19］从岸蟹中分离出富含半胱氨酸的抗菌肽，分子量为11.5kD，含有一个二硫键，对G+菌有专一抗性。1982年，Aketagawa等［20］在中国鲎和美洲鲎血细胞溶解产物中发现一种可以抑制鲎血淋巴凝固的阳离子抗脂因子，经测定该抗脂因子强烈抑制R-G－菌的生长，并具有溶血活性，自此，开辟了人类研究海洋鲎抗菌肽的道路。直至1988年，日本学者Nakamura等［6］首次在鲎血细胞中发现第一种海洋生物抗菌肽鲎素（tachyplesin）。该肽由17个氨基酸残基组成，C端α-精氨酰胺化，4个半胱氨酸，2个二硫键，具有紧密的发卡结构（图1）。在低浓度下鲎素能与细菌脂多糖结合而抑制细菌生长，并对822011年第3期宫晓静等：海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在食品保鲜中的应用真菌、病毒等有一定的抗性。随后，人们又相继发现了鲎素的几种异构体，如鲎素II、鲎素III、美洲鲎素I和美洲鲎素II等，这些异构体的氨基酸序列与鲎素有微小差异，但其活性和功能与鲎素相似。Kawa-bata等［21］在鲎血细胞的小颗粒中发现一种类似防御素的含有77个氨基酸残基的大防御素（bigde-fensin），该肽N-末端是一个含有35个氨基酸残基的疏水序列，C-末端的37个氨基酸序列与哺乳动物嗜中性细胞防御素序列类似，二硫键序列则与牛嗜中性细胞β-防御素相同，抑制细菌及真菌生长。

图1鲎素I的结构3.2贝类抗菌肽目前，对贝类抗菌肽研究较为透彻的是贻贝抗菌肽。Charlet等［22］未处理的紫贻贝（Mytilusedulis）血液中分离出抗菌肽和抗真菌肽，经氨基酸序列分析，这两种肽与防御素高度类似。后来，Mitta等［23］从贻贝Mytilusedulis和Mytilusgalloprovincalis血清中分离出4类抗菌肽，它们分别是：（1）防御素（MGD），包括MGD-1、-2。MGD-1广谱抗菌，而对真核及原虫无细胞毒性；含有38个氨基酸残基，1个螺旋结构，2个反相β-丝条结构，4个二硫桥，8个半胱氨酸，其半胱氨酸数比甲壳类防御素多2个；MGD-1具有防御素类抗菌肽的典型CSαβ结构［5］（Cysteine-stabilizedαβ，图2）。（2）贻贝素（mytilin），包括MytilinA、B、C、D、G1。富含半胱氨酸残基，三维结构高度紧密；MytilinA、B从Mytilusedulis血清中分离得到［22］；而MytilinC、D、G1从Mytilusgalloprovinca-lis血细胞中分离得到［24］。（3）贻贝肽［25］（myticin），包括MyticinA、B。Myticin富含半胱氨酸残基，形成多个分子内二硫桥，但其连接方式与MGD-1不同，因而Myticin具有独特的抗G－菌专一性。MyticinA在贻贝血细胞和血清中都有分布；而MyticinB仅分布在血细胞中。（4）贻贝霉素［22］（mytimycin）。存在于Mytilusedulis血清中，含12个半胱氨酸，抗真菌。

图2MGD-1的结构3.3海鞘抗菌肽Azumi等［26］从海鞘（Halocynthiaroretzi）红细胞中分离出抗菌肽HalocyamineA、B，具有胞溶活性，92生物技术通报BiotechnologyBulletin2011年第3期可以抑制人类肝癌细胞的增长。Lee等［4］从柄海鞘（Styelaclava）的血细胞中发现抗菌肽ClavaninA、B、C、D，由23个氨基酸残基组成，具有α-螺旋结构，C端酰胺化，在分子大小、结构和抗菌活性上类似于从欧洲蟾蜍（Xenopuslaevis）中分离的Magain-ins。随后，Lee［27］纯化出能够抑制人类病原菌的抗菌肽StyelinsA、B。Zhao等［28］从柄海鞘咽组织cD-NA文库克隆了StyelinC、D、E，StyelinA-E由32个氨基酸残基组成，富含苯丙氨酸。后来，Lee等［29］从海鞘（Halocynthiaroretzi）中分离出抗菌肽Dicythaurin和Halocidin，其分子量分别为3.4kD和6.2kD，抑菌广谱。Dicythaurin呈α-螺旋构象，C端酰胺化，由单个半胱氨酸二硫键相互连接而构成；Halocidin由两个不同的单体通过二硫键的方式连接而成［30］（图3）。Hinning等［31］从海鞘（Cionasubspecies）中鉴定出一种特殊的耐盐型抗菌肽，该肽强烈抑制细菌及人类或海洋病原体，在受攻击的红细胞中强烈表达。

图3Dicythaurin的结构4海洋无脊椎动物抗菌肽在食品保鲜中的应用前景海洋无脊椎动物抗菌肽是小分子肽，扩散比免疫蛋白更迅速，因此其杀菌活力更高，“抗菌谱”更广。另外，由于海洋无脊椎动物抗菌肽对生物体本身无毒，符合人类食品安全的要求，因而其在食品保鲜、贮藏及加工上的应用具有广阔的潜在价值。Bactenecin-7是从牛嗜中性粒细胞分离得到的肽类物质，属于哺乳细胞抗菌肽的Cathelicidin家族。由于Bactenecin-7能杀死食品传播病原体和腐败微生物、抑制组织损伤、抑菌及溶菌等特性，可以用于活体产品如鱼、虾的防腐保鲜。Schnapp等［18］从岸蟹（Carcinusmaenas）中分离得到的6.5kD抗菌肽，其大小、氨基酸序列与Bactenecin-7大致相似，但抑菌活性比Bactenecin-7更强，抗菌谱更广。因此，该6.5kD抗菌肽同样具有对食品保鲜防腐的潜力。Relf等［19］分析了岸蟹（Carcinusmaenas）的11.5kD抗菌肽，研究发现该抗菌肽对革兰氏阳性菌有专一抗性，10mg/L即可杀死细菌，并且耐高温、耐盐。由此可以推断，该抗菌肽可以用于高温、高盐下易被革兰氏阳性菌污染的食品的保鲜。Khoo等［32］从蓝蟹（Callinectessapidus）中分离得到的Callinectin，其抗大肠杆菌的致死浓度仅为1.44μmol/L，因此，可以用于易被大肠杆菌污染的食品的保鲜。鲎素TachyplesinI，低浓度下能抑制细菌的生长，并对真菌、病毒有一定的抗性作用，在离体条件下，还能抑制病原虫的活性。研究发现，当鲎素浓度为500μg/mL时，病原虫活性降低94%［6］。另外，鲎素具有抗凝血作用，强烈抑制以脂多糖为媒介的因子C。因此，鲎素是一种高效的水产品防腐剂，在抑菌的同时，可以防止血液的流失，达到高度保鲜的作用。这表明对海洋无脊椎动物抗菌肽的保鲜潜能研究，是一个值得深入挖掘、有可观价值的课题。Lee等［4］从柄海鞘的血细胞中分离纯化的抗菌肽Clavanins，具有两亲性α-螺旋结构。在微摩尔浓度下，诱导细菌、真菌、原虫和肿瘤细胞的溶解。研究表明，Clavanins能杀死13种食品相关病原体，最小抑菌浓度在3－50μg/mL，具有食品保鲜的潜在价值。贻贝抗菌肽，从贻贝Mytilusedulis和Mytilusgalloprovincalis血清中分离得到，抑制细菌、酵母菌和霉菌活性。宋宏霞等［33］研究了贻贝粗抗菌肽对鲈鱼的保鲜，新鲜鲈鱼经冲洗去头后初始细菌总数对数为3.74，经贻贝粗抗菌肽、山梨酸钾和壳聚糖浸泡鲈鱼30min后，晾干，在4℃下保藏，并设立空白组，9d后发现，经贻贝粗抗菌肽、山梨酸钾和壳聚糖浸泡的鲈鱼细菌总数对数分别上升至6.89、6.85和6.67，而空白组的细菌总数对数上升至7.14。说明贻贝抗菌肽具有一定的保鲜作用，并且达到了山梨酸钾和壳聚糖的保鲜效果。5研究前景及存在问题5.1研究前景由于当前在食品工业中所采用的防腐保鲜剂多为化学合成，从更安全和健康的角度出发，亟需寻找天然高效的食品防腐保鲜剂。具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。海洋无脊椎动物抗菌肽不仅具有较强03