颈培养瓶平板技术. 通过培养基组成成份的增减和细 菌增长、种类 和数量 的研究 确立了厌 氧发酵 产氢细 菌
的分离和富集培养基. 利用这些厌氧培养技术 , 已成功分离培养了 550 余厌氧菌株系.
关键词: 生物制氢; 产氢发酵细菌; 分离纯化; 厌氧操作; 培养基
中图分类号: X703
文献标识码: A
取 1 m l 细菌培养物( 活性污泥或经过倍比稀 释的活性污泥) 和 9 ml 无菌无氧水或无菌无氧生 理盐水混合, 制成 10- 1~ 10- 25倍比稀释菌液, 经 过实验对比, 选取 10- 13~ 10- 18接种固体培养基 可以获得有单细胞菌体生长而来的菌落. 用本实 验室制作的弯头毛细管转移入液体培养基中, 进 行富集扩增. 上述操作重复进行, 直至固体培养 基( Hungat e 厌氧滚管或平面培养瓶) 上的菌落和 普通光学显微镜下菌体细胞形态一致为止. 一般 进行/ 固体- 液体0培养基反复操作 2~ 5 次. 1. 4 氢气量和产氢能力测定
2 结果与讨论
211 Hungate 滚管技术的改良与应用 21111 培养基的配制操作
将配制好的培养基倒入一平底三角烧瓶中, 放在电热炉上加热. 加热之前通入高纯氮气( 99, 99% ) 驱除三角瓶内气相空气. 当气体通过煮沸 的培养基表面时, 培养基轻轻煮沸. 当培养基完 全无氧时( 通过刃天青指示剂的颜色变化来指示, 无氧时刃天青无色) , 既可移入厌氧螺旋管. 移入 培养基用 10 ml 注射器, 并采用平头兽用针头( 长 约 10~ 15 cm) , 将注射器和针头放入煮沸培养基 内部时同时进行氮气吹培养基容器和瓶. 21112 滚管技术
氢具有十分重要的意义.
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哈尔滨工业 大学学报
第 36 卷
1 材和方法
111 供试菌种与活性污泥 供试纯菌种来自本实验室分离得到的高效产
氢细菌 B49[ 5] , 供试污泥来自本实验室生物制氢 反应器. 112 细菌分离
从生物制氢反应器中取 10 ml 产氢发酵活性 污泥, 放入事先充满氮气无氧灭菌的培养瓶中, 加 入 10 粒玻璃珠, 在振荡器中振荡 1 h 或手工摇瓶 30 min, 将污泥中菌胶团打碎, 用脱氧无菌水或脱 氧无菌生理盐水进行 10 倍为基准的倍比稀释, 再 接种于固体培养基之中或平板培养或制成滚管培 养. 培 养时间为 20 d, 通过 MPN 法估计菌体数 量[ 15] . 1. 3 纯化富集
HP B- L R 培 养基: 根据 H PB- 1、H PB- 2、 HP B- 3 和 L M- 1 四种培养基的实验结果, 综合 而成的培 养基 HPB - L R, 成 份如下 ( g/ l) : 葡萄 糖, 2010; 胰 蛋白 胨, 110; 蛋白 胨, 310; 牛肉 膏, 210; 酵 母汁, 110; N aCl2, 310; K 2HP O4, 110; L 半胱氨酸, 015; 维生素液与微量元素( 抗坏血酸, 01025; 叶 酸 0101, N ICl216H2O, 01001; CaCl212H 2O , 0101, ZnCl2, 0102 ) 10 ml; 刃 天 青
采用林明[ 9] L M - 1 培养基作为本项研究的 起始培养基. 11512 改进培养基
HP B- 1 培养基( g/ l) : 葡萄糖, 20; 胰蛋白胨 + 蛋白胨( 110+ 310) ; 牛肉膏, 210; 酵母汁, 110; NaCl, 310; K2HPO 4, 110; Mg Cl2, 0105; FeSO417H2O , 0105; L - 半胱 氨酸, 015; 另 加 L M 1[ 9] 维生素液和微量元素液; 刃天青( 012% ) ; 110 ~ 210 ml; 琼脂, 2010g 或 不加 琼脂成 液体 培养 基.
产氢发酵细菌的产氢能力和产氢气量的测定 方法和装置见文献[ 5] . 1. 411 改良 Hungat e 滚管技术[ 1]
无菌水和培养基的制备及分离培养涉及菌种 操作环节采用简化的 H ungate 厌氧技术. 以高纯 氮气吹脱厌氧管内的空气( 氧气) , 用厌氧螺旋管 装液体和固体培养基, 35 e 常规培养, 手工冷水中 滚管. 11412 平面厌氧操作技术[ 16~ 18] 1141211 厌氧管斜面法
并下压, 使皿内不留气泡. 并用琼脂密封皿盖与 皿底边缝间隙. 11413 平板培养瓶厌氧技术
利用宽体窄颈瓶形成培养瓶底部的平面, 进 行菌液涂布或滴加菌滴并轻摇涂布法, 操作按氮 气吹脱培养 瓶内空气 ( 氧 气) . 配制培养 基过程 中, 利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹 脱瓶内气相空气的方式, 保证严格厌氧. 多加琼 脂 012~ 015% , 吸收多余水分. 同样的操作技术, 配制成液体培养基, 进行菌体富集增量. 全部实 验操作采用吹氮气脱氧和加热驱氧. 115 培养基 11511 基本培养基
固体培养基的滚管技术是指将装有热熔的厌 氧管放入装有冷水的平底盆中迅速不断转动而制 成. 当琼脂围绕管壁完全凝固后, 琼脂滚管即可 垂直放置贮存, 并可使少量未凝结的水分集中在 底部. 当管内培养基在 45 e 左右未凝结时, 用注 射器将稀释比配为 10- 10~ 10 -菌15液注射入培养管 中, 然后滚管. 灭菌管接种时, 橡皮塞在火焰上灼 烧, 稍冷后通过橡皮塞注入菌液. 21113 厌氧细菌分离
文章编号: 0367- 6234( 2004) 12- 1589- 04
The experimental anaerobic operation of isolation and culture on hydrogen- producing and fermentative bacteria
L I Yong- f eng, REN Nan- qi, CH EN Ying, LI Jian- zheng , HU L-i jie, ZHENG Guo- x iang
( 012% ) 1 ml; 琼脂 20~ 2510 g 或不加琼脂或液 体培养基; pH 调整为 410~ 415. 116 培养条件
高压灭菌 115 e 30 m in, 恒温培养或震荡培 养, 转速 120 r/ m in.
第 12 期
李永峰, 等: 发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术
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HPB- 2 培养基( g/ l) : 碳源、氮源与大量元素 同 LM- 1 培养基[ 9] ; 维生素液中只加具有还原性 的抗坏血酸 01025 g/ l 和叶酸 0101 g/ l, 10 ml. 另加 微量元素液同 L M- 1[ 9] . 加琼脂 2010 或不加 琼 脂, 其它同 HPB- 1.
利用厌氧螺旋管装入培养基 3 ml, 将其摆成 尽可能的斜面, 垂直培养. 1141212 平皿夹层厌氧法
培养基经灭菌后无菌条件下倒入一层营养琼 脂, 厚度与培养皿高度相近为宜, 用稀释菌液涂布 冷却后的培养皿( 同好氧操作) . 涂布后让菌液渗 透 5 分钟, 然后揭开培养皿一边将营养琼脂再度 倒入, 直到营养琼脂将溢未溢/ 凸起0状态( 这一点 靠粘稠的营养琼脂表面张力) , 随后迅速盖上皿盖
第 36 卷 第 12 期 2 0 0 4 年 12 月
哈尔滨工业大学学报 JOURNAL OF HARBIN INST IT U T E OF T ECH NOLOGY
V ol1 36 No1 12 Dec. , 2004
发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术
李永峰, 任南琪, 陈 瑛, 李建政, 胡立杰, 郑国香
琐; 与此同时过去要求技术设备试剂要求高, 限制 了厌氧菌的研究, 厌氧菌各学科的研究进展都大 大落后于普通好氧菌. 用厌氧分离培养技术, 国 内外 学 者 也 开 展 了 分 离 高 效 产 氢 菌 种 的 研 究[ 5- 14] , 但是, 大多数学者未能分离到具有高效 产氢能力的细菌, 即使分离到产氢菌种也仅仅局 限在 2~ 3 个 菌属[ 6~ 11] . 为 了能够 获得 目标细 菌, 一些学者配制了复杂成分的培养基, 但是有些 成分并不是该微生物所需, 例如分离到高产氢能 力菌种的 K umar[ 11] 和任南琪等[ 5] 的培养基成份 就十分复杂, 也存在进一步简化的必要. 在研究 厌氧分离技术的基础上, 研究出新的厌氧发酵细 菌培养基对分离和富集产氢发酵细菌和工业化制
( 哈尔滨工业大学 市政环境学院, 黑龙江 哈尔滨 150090)
摘 要: 厌氧产氢细菌的分离纯化与培养是发酵法生 物制氢 技术的基 础课题 之一, 现有厌 氧细菌 的分离 制
备技术和培养基分别存在着操作繁琐和成份复杂问题. 通过厌氧培养技术比较和细菌生长试 验, 确 定了/ 煮
沸吹氮去氧, 固液交替分离0 的厌氧产氢细菌分离纯 化培养程 序, 改进了 Hungate 技术和建 立了新 的宽体 窄
收稿日期: 2003- 12- 10. 基金项目: 国家杰出青年科学基金资助项 目( 50125823) ; 国家 重
点基础研究发 展规划 资助项 目( G2000026402) ; 哈 尔 滨工业大 学跨 学科 交叉性 研究 基金 资助 项目 ( HIT . M D20021 25) . 作者简介: 李永峰( 1961- ) , 男, 博士研究生; 任南琪( 1959- ) , 男, 教授, 博士生导师, 特聘教授.
( School of M unicipal and Enviro nmental Eng ineering, Harbin Institute of T echnolog y, Harbin 150090, China)
Abstract: Isolat ion and culture of hy drog en- producing and ferment at ive bact eria is an import ant foundat ion on biohydrogen product ion process. T here are com plicated operat ion and composit ion in present anaerobic techniques and cult ure media. Hungat e technique w as im proved and plat e of cult ure bott le w as est ablished by com paring anaerobic methods and bacterium grow th. Isolat ion and enrichment culture media w ere conf irmed by the t est of diff erent com posit ion and the species and amount of hy drog en- producing and fermentat ive bact erium. 550 bacterium st rains were isolated by the anaerobic operat ion. Key words: biohydrogen product ion; hydrogen- producing and ferment at ive bact eria; isolation and cult ure; anaerobic operat ion; culture media