细胞内液泡系和线粒体 的活体染色
一、实验目的
1. 了解活体染色的定义及原理； 2. 熟悉液泡系和线粒体活体染色的方法
和步骤。
二、定义及原理
• 所谓活体染色，是指利用某些无毒或毒性较小的染色 剂显示出细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影 响细胞的生命活动，不产生任何物理化学变化以致引 起细胞的死亡的染色方法。即在染色和观察过程中， 细胞或组织始终保持其生命状态。
死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液 泡内，用中性红染色不产生液泡着色现象；相反，中性 红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合， 而使原生质与细胞核带微红色 。
在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡 除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、 微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬 泡，都是由一层单位膜包围而成。这些细胞器几乎 每个细胞都有。
1. 原理：中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色 范围 pH6.4～8.0之间（由红变黄）。其胶粒表面 带阳离子，被染部分具阴离子，它们彼此之间就 发生了电吸附作用（静电吸附）。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收 中性红并向液泡中排泌。由于液泡为酸性，因此进入液 泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色。原生 质和细胞壁一般不着色。
软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高 尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维 等，因而液泡系发达。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡 系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核 不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. 健那绿(Janus green B)染液，原来也曾译为 詹纳斯绿B，是专一性染线粒体的活细胞染料，线 粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有 色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还 原，成为无色状态。因此可以使活细胞中的线粒体 呈现蓝绿色，而细胞质接近无色。线粒体能在健那 绿染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍 显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布。
• 活染法弥补了活体观察法不能显示细胞精细结构的不 足，也避免了固定染色法对细胞结构的破环和造成人 为假象的弊病。遗憾的是，适宜活体染色的染料较少， 能显示出的结构和种类也不多。
• 活体染色分为体内活染和体外活染两种。前 者是将染料注射于生物体内，染色后再取材 观察。后者是取材后，对离体的活细胞进行 染色。为保持离体细胞的正常存活，染色时 需供给细胞以正常的温度，渗透压，PH等。
三、操作程序
• 用解剖针破坏蛙的脊髓，然后把腹部皮肤剪开，使露出胸骨的 剑突部分，剪取一小块剑突软骨边缘最薄的部分，放入载片中 央的中性红染液中，染色10—30分钟，盖上盖玻片。用高倍镜 观察，可见软骨细胞为椭圆形、细胞核清楚易见，在细胞核的 上方有许多被染成玫瑰红色的大小膜泡，此区即液泡系。
• 取蛙肝脏边缘米粒大小的一块组织，放入10--20ml生理盐水中 洗涤去除血液，用吸水纸吸去多余水分，将肝组织置于滴有健 那绿-B的载玻片上，用镊子撕拉肝组织，然后将整块的肝组织 移出，染色10min左右，加盖玻片观察破碎的肝细胞。可见玻片 上有形状规则的椭圆形血细胞，形状不规则的近于方圆形的肝 细胞、细胞核及核仁及远远小于细胞的做不规则运动的线粒体。
• 用镊子撕取玉树叶叶片下表皮，健那绿-B染色10分钟，可在细 胞质中看到随细胞质环流而运动的被染成兰色的线粒体;
• 撕取莴笋叶下表皮，置于中性红中染色10分钟，可见许多大小 不同的液泡。
实验报告
绘制中性红活染的液泡系图和健 那绿-B活染的线粒体图，做好图例和 标注。