吸收明胶海绵中明胶交联度的测定董智(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂,南京210038)摘要 目的:研究国产吸收性明胶海绵中明胶的交联程度,为进一步提高该产品质量和性能提供依据。
方法:利用2,4,6-三硝基苯磺酸与肽链中赖氨酸侧链ε-氨基发生反应,生成在346n m 波长处有最大吸收峰的三硝基苯衍生物,测定明胶与甲醛发生交联前后明胶蛋白质肽链赖氨酸侧链ε-氨基数量的变化,就可推知吸收性明胶海绵中明胶的交联程度。
结果:利用此方法测得国产吸收性明胶海绵样品中明胶的交联度约为60%。
结论:该方法可测定吸收性明胶海绵中明胶的交联度。
关键词:吸收明胶海绵;明胶;交联度中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2010)03-0511-02Deter m i n ati on of cross -li n ki n g degree of gel ati n i n gel ati n spongeDONG Zhi(Nanjing J inling Phar maceutical Fact ory Nanjing 210038,China )Abstract O bjecti ve:T o study and i m p r ove the quality of gelatin s ponge,the cr oss -linking degree of gelatin in the p r oduct is deter m ined .M ethod:The cr oss -linking degree of gelatin is deduced fr om the difference of a mount ofε-a m ino -gr oup s of lysine in pep tide chain of gelatin bef ore and after the cr oss -linking of gelatin with f or malde 2hyde,which is deter m ined by using the reacti on bet w een T NBS and the a m ino -gr oup s of a m ino acid .Result:The cr oss -linking degree of gelatin of domestic gelatin s ponge sa mp les is about 60%.Conclusi on:The method appears suitable for the deter m inati on of cr oss -linking degree of gelatin in gelatin s ponge .Key words:cr oss -linking degree;gelatin;gelatin s ponge 作者Tel:013585176392、(025)85801999-8732;E -mail:zhidongnjjsch@sina .com 明胶是一种从动物结缔组织中提取的蛋白质,一级结构包含20种氨基酸。
[1]吸收性明胶海绵是明胶的水溶液以甲醛作为交联剂,在剧烈搅拌下发泡,经冷冻成型、干燥、灭菌制成的不溶于水的无菌海绵状物,在临床上用于创面止血。
吸收性明胶海绵就其化学本质而言是经甲醛交联的明胶。
甲醛与明胶发生交联反应的主要机理是甲醛在肽链中赖氨酸侧链ε-氨基与精氨酸侧链胍基间形成亚甲基桥[2]。
测定吸收性明胶海绵中明胶的交联程度是进一步研究该产品与提高产品质量和性能的必要条件,作者未见文献报道。
本文参照相关文献[3]对国产吸收性明胶海绵进行了研究。
1仪器、试剂与样品仪器:可见-紫外分光光度机(GE NERAL 公司,T U -1221型,)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂,YXQ -LS -75SII 型,);试剂:2,4,6-三硝基苯磺酸(5%水溶液,Sig 2ma 公司)、碳酸氢钠(天津市博迪化工有限公司)、盐酸和乙醚(上海中试化工总公司);样品:药用明胶(派宝明胶有限公司)、吸收性明胶海绵(南京金陵制药厂)。
2试验过程精密称取海绵(或药用明胶)11mg,加水100mL 浸泡数小时,并时常振摇。
取出海绵,用滤纸轻轻挤压吸干水份后置50mL 具塞试管中,加4%碳酸氢钠溶液1mL 和015%T NBS 溶液1mL,于40℃水浴加热4h,加6mol ・L -1盐酸溶液3mL,置热压灭菌器内于120℃加热1h,所得溶液加水5mL 稀释,用乙醚萃取3次,每次20mL,弃去乙醚层。
吸取水相5mL,水浴加热15m in,冷至室温后加水15mL 稀释,摇匀,在346nm 波长处测定吸光度。
另精密称取药用明胶11mg,置50mL 具塞试—115—药物分析杂志Chin J Phar m Anal 2010,30(3)管中,在加015%T NBS溶液1mL之前就加入6mol ・L-1盐酸溶液3mL,其余操作同上,所得溶液作为空白溶液。
3试验结果试验结果见表1。
明胶蛋白质肽链中赖氨酸侧链ε-氨基的数量按下式计算,单位为mol・g-1。
赖氨酸侧链ε-氨基量=(A×0102×2)/ (1146×104×b×X),其中A为吸光度,1146×104为三硝基苯衍生物的摩尔吸收系数;b为光程,单位为c m;X为样品重量,单位为g。
表1吸收性明胶海绵交联度测定试验结果Tab1 Result of deter m i n a ti on of cross-li n k i n g degree of gel a ti n i n gel a ti n sponge样品名称与批号(samp les na me and batches number)样品重量(sa mp les weight)/g吸光度(abs orbance)ε-氨基数量(a mount of a m ino gr oup s)/×10-3mol・g-1ε-氨基数量平均值(mean value of a mountof a m ino gr oup s)交联度(cr oss-linkingdegree)/%明胶(gelatin)08064801011511277013040101151133801319010117112580129501306/海绵(s ponge)071211010115014610111001011101380010940101160149401117011076511海绵(s ponge)080311010111013990109801011501377010900101140137401090010936917海绵(s ponge)0901010101100160201150010106014400111401010801532011350113356164讨论4112,4,6-三硝基苯磺酸(以下简称T NBS)在碱性条件下可与氨基酸的伯氨基反应生成三硝基苯衍生物。
该衍生物在346n m波长处有最大吸收峰,据此可测定肽链中赖氨酸侧链ε-氨基的数量。
通过明胶与甲醛发生交联反应前后明胶蛋白质肽链中赖氨酸侧链ε-氨基的数量变化,就可推知明胶与甲醛发生交联的程度。
412 吸收性明胶海绵残留有交联剂甲醛,测定前须用水浸泡,以去除残留的甲醛,避免干扰测定。
413 加6mol・L-1盐酸溶液是使溶液呈酸性,一方面使蛋白质肽链水解,同时,也阻止肽链水解产生的α-氨基与T NBS发生反应。
制备空白溶液时,在加T NBS溶液前先加6mol・L-1盐酸溶液,是阻止ε-氨基与T NBS发生反应。
414 乙醚可萃取出溶液中未反应的T NBS以及肽链水解产生的α-氨基与T NBS反应生成的三硝基苯衍生物。
415 试验中明胶样品的供试液吸收值已大于1,说明明胶在与甲醛发生交联前含有大量的赖氨酸侧链ε-氨基。
通过增加溶液稀释倍数,可使之在012～018之间,从而增加测定的准确度。
416 吸收性明胶海绵产品本身就不具有均一性,再加上测定方法本身的因素,测定结果在一定范围内变动是预料之中的,但测定结果已能表明产品中明胶的交联程度,可为进一步研究提供依据。
417 由于目前未见有文献报道用其他方法测定该产品中明胶的交联度,故无法将该测定方法与其他测定方法进行比较研究,以确定该方法的准确度。
参考文献1PENG B i-xian(彭必先),CHENG L i-juan(陈丽娟).Fr om the collagen t o the gelatin(从胶原到明胶).The Sci Technol gelatin (明胶科学与技术),1994,14(1):12T ANG Hui-ru(唐惠儒).13C NMR Studies of Cr oss-linking Re2 acti on bet w een Gelatin and For maldehyde(碳-13核磁共振波谱法对甲醛和胶原交联反应的研究).China Leather(中国皮革), 1993,22(10):32Ofner III Clyde M,BubnisW illiam A.Chem ical and s welling evalu2 ati ons of am ino gr oup cr oss-linking in gelatin and modified gelatin matrices.Phar m Res1996,13(12):1821(本文于2009年4月6日收到)—215—药物分析杂志Chin J Phar m Anal2010,30(3)。