9
Mouse model of cryptococcosis
10
血脑屏障模式图
11
病原体穿越血脑屏障的方式
1
2
3
ECM
1: 细胞内侵袭 2: 细胞旁通过－打开紧密连接 3: 木马机制：通过巨嗜细胞穿越
病原体 巨嗜细胞 血脑屏障 紧密连接
12
检测新生隐球菌通过血脑屏障的体外模型
新生隐球菌
血液侧 脑侧
20
新生隐球菌对C57BL/6小鼠大脑皮质作用研究
小鼠大脑皮质Bcl-2在 不同时相点的比较
不同时相点的小鼠大脑皮质 凋亡细胞比较
不同时相点的小鼠大脑皮质 Bax比较
21
新生隐球菌对C57BL/6小鼠大脑皮质作用研究

22
初步结论
新生隐球菌入血后到达血脑屏障， 通过相关细胞因子如IL-6和VEGF等作用引起 脑微血管内皮细胞的凋亡， 紧密连接开放，细胞间隙增大，并可能使血脑 屏障完整性被破坏， 穿越血脑屏障，感染宿主脑组织
CHANGZHENG HOSPITAL, SHANGHAI
1
隐 球 菌 病 的 致 病 菌
2
C
C.
3
MATa X MATa
Life Cycle
Mature basidia
a
Conjugation
Dikaryotic hyphae
4
Cryptococcosis: Route of infection and dissemination
7
新生隐球菌致病机理中 几个关键问题
新生隐球菌是如何穿过血脑屏障后进入中枢 神经系统的？ 为什么新生隐球菌易于感染中枢神经系统？ 新生隐球菌进入机体的途径是否只有吸入肺 部后入血一个？
8
新生隐球菌通过血脑屏障的机制研究
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）建立血脑屏障 模型，观察新生隐球菌对HUVEC的影响 新生隐球菌静脉感染C57BL/6小鼠后，检测 大脑皮质内新生隐球菌感染情况，大脑皮质 内细胞凋亡及大脑皮质中特异蛋白的表达
紧密连接胞质附着蛋白 ZO-1 血管渗透因子VEGF
IL-6
HUVEC 紧密连接相关蛋白表达
19
新生隐球菌对C57BL/6小鼠大脑皮质作用研究
大脑皮质透射电镜 A：C group B：24h C：72h D：C group E：24h F：72h
大脑皮质PAS染色 A：C group B：CTX group C：0.5h D：2h E：6h F：12h G：24h H：72h
实验组蛋白二维凝胶电泳图谱
对照组蛋白二维凝胶电泳图谱
26
实验组与对照组细胞蛋白表达差异
共找到可信差异表达蛋白点19个 5个蛋白点仅在对照组细胞中表达 3个蛋白点仅在实验组细胞中表达 10个蛋白点在实验组细胞中表达降低 1个蛋白点在实验组细胞中表达升高
27
差异表达蛋白点肽指纹谱鉴定
S100A10 Prx Ⅰ Prohibitin (PHB) HSP27 Malate dehydrogenase CacyBP PSA7_HUMAN cofilin
Filterinsert
HBMEC 单层 半通透膜
13
新生隐球菌对血脑屏障内皮细胞凋亡的影响
A: 对照组 B: 2h C: 6h D: 12h
新生隐球菌侵袭血脑屏障EC细胞的凋亡率
14
新生隐球菌侵袭血脑屏障透射电镜
A: 对照组 B: 0.5h C: 0.5h D: 0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h
Brain
Blood stream
5
隐球菌病
病原菌: 易感因素 :
感染途径 : 易感器官： 预后 :
分布 :
新生隐球菌
HIV, 淋巴瘤, 激素治疗, 器官移植 原发性CD4 淋巴细胞减少 吸入，皮肤，胃肠道？ 脑、肺、皮肤、骨和关节
未治疗的脑膜炎死亡率为100% 世界范围
6
新生隐球菌的毒性因子
荚膜 黑素 磷脂酶 37 ℃下生长良好
28
隐球菌嗜中枢性可能的相关机制
增强细胞骨架活动能力，促进细胞胞吞胞吐活动 减少HUVEC对氧应激的耐受能力，细胞损伤增 加，增殖能力下降 促进细胞凋亡 影响了HUVEC正常的细胞内信号转导过程 抑制细胞能量代谢
29
皮肤隐球菌感染的研究
小鼠原发性皮肤隐球菌感染模型的建立 宿主免疫状态、隐球菌变种和荚膜与皮肤 隐球菌感染的关系 小鼠隐球菌皮肤感染后是否发生播散 人角质形成细胞株－HaCat体外与新生 隐球菌相互作用
15
新生隐球菌侵袭血脑屏障EC扫描电镜结果
A: 对照组 B: 2h C: 6h D: 12h
16
HUVEC Bcl-2(抑凋亡基因)的表达被抑制
A：对照组 B：2h C：6h：D：12h
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HUVEC Bax (凋亡基因)的表达被启动
A：对照组 B：2h C：6h：D：12h
18
新生隐球菌对血脑屏障紧密连接通透性的影响
23
隐球菌脑膜炎发病机制
新生隐球菌的跨膜作用 穿越脑微血管内皮细胞紧密连接 脑微血管内皮细胞凋亡 其它相关因子导致的通透性的增加
24
新生隐球菌嗜中枢性的研究
利用蛋白质组学技术分析新生隐球菌与 血管内皮细胞共孵育后血管内皮细胞蛋 白质谱的变化 筛选差异表达蛋白，并在基因的转录层 面进行验证
25
血管内皮细胞总蛋白差异表达谱
30
31
小鼠原发性皮肤隐球菌感染模型
传染性软疣样皮损 溃疡
结节样皮损
PAS染色
32
小鼠隐球菌感染后的血行播散
免疫抑制与免疫正常小鼠各个脏器及血液真菌培养 均为阴性 免疫抑制小鼠血清乳胶凝集试验阳性 乳胶凝集试验是目前比较成熟的技术，在去除试验 本身因素影响后，其阳性率接近100％ 免疫严重受损的患者，皮肤局部创伤后大剂量接种 隐球菌还是可能引起播散性的隐球菌感染
10%
5%
0%
0.5
1
2
4
时间：h
cap64 B3501 ATCC32609
新生隐球菌对角质形成细胞活力的影响
30
25
20
15
10
5
0
0.5
1
2
时间：h
cap64 B3501 ATCC32609 空白对照 killed-B3501
通过率
调亡率：％
新生隐球菌对角质形成细胞的时间通过率
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隐球菌皮肤致病性中的影响因素
免疫抑制的作用可以使隐球菌感染皮损出现 时间提前，感染加重。 无荚膜株与父代有荚膜株在皮肤的致病力方 面没有明显差别 两个变种之间的致病力没有显著差别
34
新生隐球菌对角质形成细胞的时间粘附率
35%
30%
25%
20%
15%