方法一：先 培养微生物 ，再加入刚果红进 行颜色反应。（后置染色法） 方法二：在 倒平板 时就加入刚果红。
（前置染色法）
补充：
方法一中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红， 以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶 活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖 底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能 分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结 合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红 洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈 当然分解纤维素的能就强！
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
水
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂） B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有， 是如何进行选择的？ 有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择 培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤 维素改为葡萄糖。
五、课题延伸
为了确定分离得到的是纤维素分解菌，
发酵产纤维素酶 还需要进行_____________ 实验，纤维素酶的 发酵方法有______ 固体 发酵。纤 液体 发酵和______
维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤
维素所产生的________ 葡萄糖 含量进行定量测定。
课堂总结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离 纤维素酶 种类、作用
②各加入一张滤纸条
③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L 的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml ④在乙试管中加入1mL纤维素酶 ⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在 140r/min的摇床上振荡1h ⑥结果：乙试管的滤纸条消失
甲
乙
（二）纤维素分解菌的筛选
刚果红染色法 。 1、筛选纤维素分解菌的方法______________ 颜色 反应直接筛选。 该方法可以通过________ 2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成 红色复合物 ，当纤维素被_________ 纤维素酶 分解后， ____________ 纤维素分解菌 红色复合物无法形成，出现以_____________
分解纤维素的微生物的分离
课题重难点：
从土壤中分离分解纤维素的微生物
一、基础知识
㈠纤维素与纤维素酶
1.纤维素
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高 分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
土壤中某些微生物能够分解利用纤维素，
原因是能产生 纤维素酶
2.纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括 三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶
说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基
配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少 量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中 生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，
因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量
繁殖。
2、选择培养 ①目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从 样品中分离所需要的微生物。
②制备选择培养基： ③操作：
D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛 选出了纤维素分解菌
(三)、实验设计
土壤
取样
什么 样的 环境 取样?
选择 培养
梯度
稀释
将样品涂 布到鉴别 培养基 ①鉴别培养基 的特点? ②如何鉴别?
挑选 菌落 挑选什 么样的 菌落?
① 培养的目的? ②选择培养基的 特点?
操作步骤
1、土壤取样：
①分布环境 富含纤维素的环境中 ②原因 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素 的环境中纤维素分解菌的含量相对提高
对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明 培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得 了分解纤维素的微生物。 2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌 的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取 土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌 等不同的分离结果。
②制备选择培养基：
培养基成分分析
培养基组成
纤维素粉 5g 提供主要的营养物质 碳源 氮源、无机盐 1.2g 0.5g 无机盐 生长因子、碳源、氮源 氮素、生长因子
NaNO3 1g KCl 0.5g KH2PO4 0.9g Na2HPO4· 7H2O MgSO4 · 7H2O 0.5g 0.5g
酵母膏 水解酵素
应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那
些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制， 因此可以起到“浓缩”的作用。
比较 项目
选 择 培 养 原理 培养基类 型 目的
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
原 鉴理 定 培 养 现 观察菌落周围是否有着色的 观察菌落周围是否出现 基 象 环带出现来鉴定尿素分解菌 透明圈来筛选纤维素分解菌 方 刚果红染色法 脲酶检测法 法
D） 3下列对刚果红染色法的叙述，不正确的是（
A.可以先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应 B.可以在倒平板时就加入刚果红
C.既可以先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应， 也可以在倒平板时就加入刚果红 D.可以将刚果红与培养基中的其他物质混合后再灭菌倒 平板
5、挑选菌落
挑取产生明显的透明圈的菌落， 一般即为分解纤维素的菌落。 接种到纤维素分解菌的选择培养 基上，在300C－ 370C培养，可进一步 纯化培养。
C1酶、Cx酶 葡萄糖苷酶
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
练一练：
1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是 A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种
B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁
D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖
实验：纤维素酶分解纤维素的实验
①取二支20mL的试管
将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶 中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振 荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复 选择培养。
3.梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后 的菌液进行等比稀释101～107倍。
10
1
10
2
10
3
10
4
105
106
4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养 基上 （1）制备鉴别培养基:
鉴别纤维素分解菌的培养基
培养基组成 CMC-Na 5~10g
(水溶性羧甲基纤维素钠)
提供的主要营养物质
碳源 碳源、氮源、生长因子 无机盐 碳源、生长因子 凝固剂
酵母膏 KH2PO4 土豆汁 琼脂
1g 0.25g 100mL 15g
上述物质溶解后，加蒸 馏水定容至1000mL
氢元素、氧元素
刚果红染色法
透明圈 ，可以通过___________________________ 是否产生透明圈 为中心的________ 来筛选纤维素分解菌。
2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解 菌，下列说法错误的是 A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物
B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物
C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物
纤维素分解菌
以尿素做唯一氮源 主要以纤维素粉做碳 选 原理 的选择培养基 源的选择培养基上 择 培 养 培养基类 液体培养基 固体培养基 基型（物理） 筛选菌株 选择培养 目的 鉴 原理 定 现象 培 养 方法 基
思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些 异同？ 本实验流程与课题2的流程的区别如下。课 题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为 唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌 落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得 到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其 他步骤基本一致。
在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果pH升高指示剂会变红
刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈
比较项目 分解尿素的细菌
前置染色法 筛选原理 刚果红染色 后置染色ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 土壤取样 富含纤维素土壤
实 验 设 计
选择培养
增大分解菌含量
梯度稀释
涂布培养 挑选菌落
染色鉴别
（2）涂布平板： 将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml 涂布到平板培养基上，30℃倒臵培养。
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生 物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适
这两种方法各有哪些优点与不足？
染色法 优点 缺点
颜色反应基本 操作繁琐 方法一 上是纤维素分 刚果红会使菌落之间发生 解菌的作用 混杂 1.产生淀粉酶的微生物也 操作简便不 产生模糊透明圈 存在菌落混 2.有些微生物能降解色素， 杂问题 形成明显的透明圈。
方法二
四、结果分析与评价
1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选 出菌落
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年 积累的枯枝败叶等。
④如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤 中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对 集中，实际上是人工设臵纤维素分解菌生存的 适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的 土壤中。
2、选择培养 ①目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从 样品中分离所需要的微生物。