纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
4、牛肉膏蛋白胨固体培养基；5、生理生化特征鉴定培养基。
四、实验步骤：1、菌种分离菌种初筛。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，15℃下培养10 d。
重复此操作至菌种初步纯化。
2、菌种复筛。
用接种环从已初步纯化的初筛平板上滤纸水解透明圈的菌落处，刮取菌种在复筛平板上划线，15℃下培养7 d，得到单菌落。
将分离纯化的单菌落回接到初筛培养基上，观察其对滤纸的分解。
将分离到的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨培养基上。
15℃下培养7 d,4℃保留菌种或用作各种鉴定。
3、菌种形态观察个体形态观察。
对细菌进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色，观察结果；进行牛肉膏蛋白胨半固体培养基(含琼脂O．4％)穿刺接种，观察游动性；对菌体形态进行镜检，菌体大小采用数字显微图像处理软件MIE测量。
4、菌落形态观察。
在复筛培养基上15℃下培养7 d，进行菌落形态观察。
5、菌株最适温度与ph的测定将筛选菌株分别在II、15、20、25、29、37℃下涂布培养5 d(密度不可过高)，至少选取加个单菌落测量其直径，绘制3株菌的单菌落平均直径随温度的变化曲线，作为最适生长温度的参考。
同样．不同pH梯度下涂布培养5 d，测量单菌落平均直径，绘制其随pH的变化曲线，作为最适生长pH的参考。
6、生理生化特征鉴定采用“1．2．4”所述的生理生化反应鉴定培养基对筛选的3株菌进行鉴定。
7、16srDNA鉴定菌株VCR模板制备㈣9。
取培养3 d的平板单菌落悬于50m无菌蒸馏水中，于100℃水浴5—10 min，取出立即放置冰上，保存。
16S rDNA的PaR扩增与测序。
采用上海生工生物工合成的l对16S rDNA引PCR扩增条件：94℃预变性5 rain，94℃变性45 s．50℃退火45 s，72℃延伸，50 lll反应体系30个循环后再72℃延伸5 min。
8、序列比对与系统发育树的构建。
将测得的16S rDNA序列在Genlhnk上进行BLA．gI"比对，对获得的同源序列进行序列分析。
取同源性较高的不同种的模式序列(Type Strain)用MEGA 4。
10：进行多序列比对并构建系统发育树。
五、结果与分析：1、菌株的筛选通过菌株的初筛、复筛和同接试验，共分离出15种具有纤维素降解活性的菌株。
其中的13株细菌，分别命名为WHI—WHl3。
测量15℃下培养10 d的滤纸分解圈．WHl2平均为7．0咖．WH3为5．5 rrlin，Will为5．0 ml'n，其他菌株均在3．0 mm以下。
选取菌株Will、WH3、WHl2继续研究。
菌株wHl2对滤纸分解能力最强．15℃下培养10 d．该2、菌种形态观察结果1个体形态观察结果、通过染色，光镜(10×100)下进行形状观察和半固体培养基穿刺接种运动性观察．采用数字显微图像处理软件MIE对菌体大小进行测量，结果见表l。
3株菌均为革兰氏阴性杆菌，有荚膜．不产生芽孢．均呈杆状。
穿刺接种显示细菌沿穿刺线扩散，说明细菌口，能有鞭毛。
3、菌落形态观察结果。
对3株菌在复筛培养基上15℃下培养7 t，3株菌具有不同的菌落形态。
在复筛培养基上均为浅颜色，但在滤纸培养基上Will菌落为鲜绿色．WI-13为棕黄色。
WHl2为桔黄色。
生理生化结果显示，3种菌均能利用葡萄糖；能产生胞外呈阳性。
脂酶，但都不明显；能利用多种碳源。
WH!和WI-112能水解2．4培养特征测定结果明胶，即分泌胞外的蛋白酶；WH3和Wttl2则能水解蛋白胨中的色氨酸．产生吲哚反应；Will和WH3分解匍萄糖产酸，能使溴甲酚紫变黄(PH值5．2)但不能使甲基红变红(pH值=4．2)。
grill能分解硫代硫酸钠产生硫化氢。
4、最适生长温度。
在不同温度下培养，3株菌的培养曲用单菌落测量生长曲线虽不典型，。
但也能表现出菌的最适生长温度。
WHI和WH3在20℃左右菌落直径最大。
5、菌种鉴定上述试验结果表明3株菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
Will、WH3和WHl2都未发现类似菌落特征。
故认为3株菌属假单胞菌类。
根据3株菌生化反应特征，氧化酶反应阳性和分解蛋白质，确定不属于黄单胞菌属和滑动单胞菌属，故可能为假单胞菌属和葡糖杆菌属。
6、16srDNA饼姨鉴定结果BLAST比对。
比对结果显示菌株Will的16S rDNA测试结果为I 442个碱基，共有198条序列最大相似度(Max ldent)在99％以上，几乎均鉴定为假睢胞菌属，涉及到已鉴定的12个种。
当前普遍观点认为：16SrDNA序列同源性大于99％，可以认为属于同一种；小于98％，则可认为属于不同的种；16S rDNA序列同源性小于95％，则可认为属于不同属：¨-I 3『。
由于假单胞菌属菌种相对较复杂，相似度为99％仍不能鉴定到种，但可以确定的是Will属于假单胞菌属，同时可进一步通过构建系统发育树寻求wHl与其他种可能的进化关系。
菌株WH3的16s rDNA测试结果为：l 443个碱基(Gen．Bank序列号：H262367)。
BLASI"GenBank 的基因序列后，分析确定WH3为假啦胞菌属。
菌株WHl2的16S rDNA测得l 439个碱基(GenBank序列号：H262368)。
BLAST GenBank的基因序列后分析确定WHl2。
仍为假单胞菌属。
7、系统发育树。
通过构建同属不同种序列的系统发育树可进一步鉴定菌株的种型。
通过在Ge删数据库的BLAST．选取同属已鉴定的所有不同种12条模式种序列。
通过MEGA 4的CLUbTALW 进行多序列比对并构建系统发育树。
由于这12条序列具较高的同源性(均在99％以上)，即进化距离较短，宜采用最小演化长度法(Minim,,,n Evolmion)构建L1 4。
，．经自举法(1kmtstmp Method)检验，该树基本正确。
一般认为，当一个给定的内部树枝的自举值为95％或者更高．才认为树枝结构正确-14一二所以不能鉴定WHI具体足Pseudornor船属的哪一种，为验汪假没的正确性，随机取假单胞菌科(Pseu(b咖哪Iaccac)的4个属(Pseudomonas、Xan thomonas、Zoogloea和C．1uconobacter)的菌株构建发育树，验证发现Will属于假单胞菌属的可信度为100％，则暂定Will名为Pseudomonas sp．strain Will。
与WH3 BLAST显示的共3个不同种．参考WHI，同样选择各个种的16S rDNA序列，采用MEGA 4通过最小演化长度法构建系统发育树，选取不同种各一条模式种基因序列，采用MF_EA4通过最小演化长度法构建系经自举法检验，发育树构建基本正确。
WI-112与WHI情况相似，很难据此确定为何种．但确定认为WHl2属假单胞菌属(Pseudomonas)，暂定名为Pmudomonas sp．血dill WHl20。
8、结论与讨论综合以上结果，菌株Will、WH3和WHl2经初步鉴定可能为假单胞菌属和(或)葡糖杆菌属的种，通过16S rDNA分析进一步确定该3株细菌均属假单胞菌WH3为恶臭假单胞菌。
未曾有关其降解纤维素的报道。
试验对其做的相关特性鉴定．个别鉴定结果不同：其所述生长温度有一定降低，最适生长pH值6．5偏酸性，个别生化试验结果不同。
筛选条件的不同町能会产生条件诱导，使菌株发生了变化，正在对其有关的纤维素酶进行提取。
结论有待进一步验证。
WHl2虽与Will、WH3同属假单胞菌属，且16S rDNA序列差别不大(与WH3两两对比相似度98％)，但各方面性状表现差别很大。
假单胞菌属如此之小的16S rDNA差别致使各种反应现象差别之大的原因，很值得深入探讨。