实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定
一、实验内容
1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

2．重组蛋白的Western boltting鉴定。

二、实验要求
通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。

三、实验方法
1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析
（1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。

（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。

（3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。

（4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。

（5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。

将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。

（6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。

2．Western blot分析
（1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。

（2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。

a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。

b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。

c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、
凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。

d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。

（3）杂交
a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。

b.TBST漂洗3 × 10 min
c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中，
室温反应1 hr。

d.TBST漂洗3 × 10 min
e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
二抗工作液中，室温反应1 hr。

f.TBST漂洗3 × 10 min。

（4）显色
将膜浸泡在DAB显色液中，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。

（5）拍照和保存结果。

附：
溶液配制
电转移缓冲液
48 mmol/L Tris
39 mmol/L 甘氨酸
0.01% SDS
20% 甲醇
TBST
20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.5
0.15 mol/L NaCl
0.05% Tween-20
Western blot封闭液：TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白
抗体稀释液：TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白
DAB显色液：二氧基联苯胺，Diaminobenzidine
由图可知，重组蛋白的分子量约为45KDa，由IPTG诱导表达的全菌、上清和沉淀均有表达，由乳糖诱导的仅在全菌和上清中有表达（与没有诱导的进行比较）。

由图可知，重组蛋白的分子量约为45KDa，IPTG诱导的重组蛋白均有表达，且上清表达量高，而乳糖诱导的表达仅在上清和全菌中，而且表达量比IPTG诱导的效果差。