项目名称： 作物高效利用氮磷养分的分子机理 首席科学家： 吴平 浙江大学起止年限： 2005.12至2010.11依托部门： 教育部 浙江省科技厅一、研究内容植物高效利用土壤养分的生物学基础包括：感受和转导养分信号，根系适应性发生发育及根构型的改变（发育水平）、关键调控因子的表达或转录后变化（分子水平）、养分活化、吸收、利用及其能量代谢相关的一系列生理生化途径的变化（生理水平）。

阐明上述过程的分子机理，在发育、分子与生理水平上了解植物对养分高效吸收利用的调控机理，从而为挖掘养分高效与高产优异种质中的关键基因、进而提出作物养分高效分子育种策略。

由此，本项目拟解决的关键科学问题是：植物高效吸收氮、磷养分以及氮、磷养分代谢高效促进作物产量关键途径的分子机理及其在优异种质中的聚合效应；以聚合效应为基础的基因标记辅助选择理论与方法。

针对关键科学问题的解决，确定主要研究内容如下。

1、磷信号途径调控系统：水稻、拟南芥氮、磷信号受体，氮、磷信号与激素信号互相作用分子机制研究。

养分信号与激素信号互作的现象已有一些初步证据，如，磷饥饿胁迫信号受外源CTK抑制，高浓度氮抑制植物侧根伸长与ABA 信号关系密切，磷饥饿胁迫与生长信号均能改变根向地性等。

一些磷信号特异性标记基因也已被发现与克隆，表明磷信号具有相对独立的途径。

因此把氮、磷信号途径与激素信号途径节点的研究作为本研究的切入点，同时利用磷信号标记基因启动子与报告基因构建的融合基因，发展研究磷信号途径突变体，以期在养分信号途径研究中取得突破。

2、磷高效根构型形成的遗传基础与分子机理：根构型形态参数定量分析及磷高效根构型标记基因分子诊断系统；磷调控根系伸长和向地性变化关键基因克隆及功能分析；磷调控根毛发生伸长的分子机理研究。

利用自行设计的纸培、根箱栽培系统结合计算机图像分析技术，建立大豆（直根系代表）、水稻（须根系代表）的三维根形态构型观测与分析系统，获得不同基因型材料在不同磷水平下的根构型原位几何参数，创建三维根构型参数分析计算及图形视觉计算机模型。

利用大豆、水稻磷饥饿信号标记基因（Gm4，OsIPS1）分析不同根构型的大豆与水稻在不同土壤条件与磷水平下的表达，确定根构型表型参数与磷吸收效率的遗传相关性。

利用已获得的大豆、水稻、拟南芥根伸长与向地性突变体，研究磷调控根系伸长和向地性变化关键基因及功能。

同时利用不同根系性状亲本（如大豆深根构型基因型BD2，浅根构型基因型BX10）发展的遗传群体，进行根构型参数的QTLs分析，为分析突变体的基因背景提供遗传信息。

利用拟南芥根毛突变体材料，用激光镊子获取单细胞RNA进行单细胞基因表达谱分析，揭示磷信号调控细胞位置效应及根毛发生分析机制。

3、氮、磷转运关键基因功能鉴定及其调控因子：根据已有基础及生产中的突出问题，开展水稻高亲和磷酸盐转运体Pht1基因家族功能鉴定及调控因子研-高亲和转运体NRT2/NAR2基因家族功能鉴定及其调控因子研究。

创究；水稻NO3建水稻11个Pht1基因敲除（RNA干涉）与超表达转基因材料，创建所有OsPht1基因启动子与GUS报告基因及GFP荧光蛋白报告基因的融合基因转基因材料。

利用上述材料分析各基因功能与表达规律并指导发展双突变、三突变等材料，分析转运体间的相互作用及对磷吸收的影响；指导分析重要的顺式作用元件，开展上游调控因子研究。

OsPht1-11和西红柿的LePT4是受菌根侵染特异诱导的磷转运体基因，利用这两个基因敲除与超表达的转基因材料研究菌根在根细胞释放磷的转运机制。

在水稻中开展高亲和硝酸根转运体基因家族NRT2/NAR2的功能与调控机制研究。

发展所有NRT2和NAR2基因启动子与GUS报告基因及GFP荧光蛋白报告基因的融合基因转基因材料。

利用上述材料分析各基因功能与表达规律并指导发展双突变、三突变等材料，分析转运体间的相互作用及对氮吸收的影响；指导分析重要的顺式作用元件，开展上游调控因子研究。

用酵母双杂技术和BiFC （bimolecular fluorescence complementation）技术研究NRT2/NAR2蛋白的相互作用，将利用酵母单杂交技术分析其调控转录因子。

4、土壤磷活化相关基因功能鉴定与调控系统：植酸酶对饲料有机磷与外泌性植酸酶对土壤有机磷分解利用效率的研究。

分别从黑霉菌和假单胞菌分离Phytase A基因，从玉米、水稻中克隆其同源基因。

将植酸酶基因构建在载体pSphy 上，构建所需元件：(1)根部特异表达启动子， (2)根外分泌信号肽序列(SP)，(3)植酸酶基因与CS基因，(4)终止子(TERM)。

筛选标记Bar基因构建在载体pBar 上，构建所需元件：（1）启动子，(2) Bar基因，(3) 终止子。

另外，分别构建用于不加信号肽的植酸酶基因表达载体，同时用于转化，验证植酸酶胞外分泌和不分泌是否导致植株对磷吸收利用的差异。

5、氮、磷代谢影响农作物产量的分子机理：水稻、小麦氮、磷高效高产相关基因表达谱比较分析：利用氮、磷利用效率具显著差异的高产水稻和小麦品种作为材料，在水培或砂培条件下进行缺氮或缺磷处理、恢复供氮或供磷处理、及对照处理，在苗期和灌浆期分别取根和地上部样本（灌浆期取旗叶和发育种子），提取总RNA用于Affymetrix公司的基因组芯片进行杂交分析基因表达谱的异同。

关键调控基因的克隆及功能鉴定：对获得的转录组数据进行比较分析，找出水稻和小麦及超亲后代之间，氮磷缺乏条件和氮磷适量条件之间基因表达变化的共性和特异性；分子氮、磷代谢影响产量的分子机制；鉴定氮、磷高效高产的关键调控基因的候选基因（转录因子与代谢调控因子）。

选出5-10个预测的关键调控基因，用反向遗传学（如RNAi和TILLING等）以及基因过量表达等技术，研究它们的分子生物学功能和评价其的利用价值。

6、水稻、小麦、油菜、大豆优异种质氮、磷高效关键基因及调控机制的聚合效应：不同氮、磷水平下养分吸收量与产量构成因子QTLs分析；结合相关转运、活化、利用关键基因与基因表达谱研究结果，分析影响高产的氮、磷高效途径；提出作物养分高效分子育种策略。

以杂交稻汕优63的两个亲本珍汕97和明恢63及衍生的重组自交系群体；小麦氮、磷高效品种小偃54与对照京411及由该亲本发展的重组自交系群体；磷高效大豆B2与对照B10品种为亲本及由该亲本发展的重组自交系群体；油菜磷高效品种“97081”（湖北长角）与 对照“97009”及发展的重组自交系群体为研究材料。

利用上述材料进行根箱试验，测定根构型参数及进行根构型参数的QTLs分析；进行大田与溶液培养试验测定植株氮、磷含量和产量构成因子并进行QTLs分析；通过比较QTLs信息与氮、磷高效关键途径及其调控系统芯片分析结果，比较活化、转运关键基因的表达结果，揭示高产、高效优异品种氮、磷高效的遗传基础与分子机理。

二、预期目标总体目标探明水稻、小麦、大豆、油菜高效吸收氮、磷养分以及氮、磷养分代谢高效促进作物产量关键途径的分子机理；挖掘一批氮、磷高效关键调控因子与结构基因；提供氮、磷高效优异种质材料；加快与提高我国培育氮、磷高效（氮利用效率提高10%，磷利用效率提高20%，达到发达国家水平。

）作物新品种的速度与水平。

为发展我国持续、高效的绿色农业作出重大贡献。

同时培养和建立一支高素质的研究队伍。

五年预期目标五年内，我们将在我国主要作物氮、磷高效利用关键途径的分子机理的理论研究，氮、磷高效利用关键基因获得与利用及养分高效分子育种策略等方面取得重大进展与突破，总体上进入国际前沿水平，部分领域达到国际领先地位。

具体目标为：1、揭示磷信号转导途径关键节点，氮、磷信号与植物激素信号互作途径；2、建立磷高效根构型分子诊断理论和技术体系；深入认识磷胁迫信号调控根毛发生与伸长的分子机理；3、明确高亲和磷转运体Pht1家族基因启动子中调控表达的共同和不同的重要识别元件、克隆关键转录调控因子和明确两个以上高亲和转运体的生理功能。

明确高亲和硝态氮转运体NRT2/NAR2家族基因功能及其关键调控因子；4、建立植酸酶增强表达及根系外泌性表达转基因作物，探明其活化土壤与有机物中有机磷的效率与调控机理。

5、发现5个以上可显著提高氮、磷高效利用新基因及10份以上氮效率提高10%以上、磷效率提高20%以上的水稻、小麦、大豆优异种质材料。

6、探明优异种质氮、磷高效关键基因调控途径的聚合效应，提出作物养分高效分子育种关键参数及选择策略。

在上述成果基础上，在国内外主流学术刊物上发表学术论文100篇以上，建设一个合理的学术梯队。

在第一层次培养在国内外有较大影响的学科带头人。

在第二层次培养数名中青年学术骨干。

通过实现项目预期目标，培养研究生200人以上，博士后20人以上。

三、研究方案1.总体研究思路和项目研究的技术路线及可行性1）总体研究思路在养分缺乏条件下，植物感受、转导养分饥饿信号，启动增强活化、转运、吸收土壤养分的适应性反应，包括根系发生发育及根构型的改变，关键调控因子的表达、养分活化、吸收、利用及其能量代谢相关基因的变化；在养分适量条件下，具有促进高产潜力实现的养分高效代谢机制。

在阐明上述过程的遗传与分子本质时，我们要回答这些在发育、生理与分子水平上的适应性变化及其调控系统在养分高效与高产的优异种质中是如何发挥功能及相互作用，并由此提出氮、磷高效分子育种策略。

2）研究技术路线本项目从植物感受、转导氮、磷信号并在发育、分子与生理水平上产生适应性反应，氮、磷高效代谢途径开展研究，同时对养分高效高产优异种质的氮、磷利用遗传基础与分子机理开展研究，从而比较两个层面的研究结果，提出养分高效育种策略。

研究涉及信号转导、环境调控根系发生发育，全基因组水平上基因表达谱分析，基因克隆，QTLs定位与分子标记分析，主要作物高效转基因及基因表达研究等内容。

主要技术途径包括：利用水稻等作物磷饥饿信号标记基因启动子与报告基因融合基因突变体，及对生长素（AUX），细胞分裂素（CTK）与脱落酸（ABA）反应不敏感与超敏，根系发生伸长，向地性改变等一系列突变体为材料研究氮、磷信号转导途径与激素信号互作及调控根系发生发育的分子机理；利用自主研发的根系形态构型参数定量分析软件与实验系统，结合磷饥饿信号标记基因表达诊断分析，提出磷高效根构型分子诊断技术；以养分高效、高产优异种质及其遗传群体为材料，利用基因芯片分析、QTLs分析、代谢途径关键基因分析进行作物之间，氮、磷养分之间的比较基因组与功能基因组研究；利用基因敲除与增强表达技术，酵母双杂交技术等对重要的转运体家族基因、土壤磷活化关键基因的功能及调控因子研究。

3）项目的可行性a工作基础本项目已具备了完成本项目研究目标的大量遗传材料，包括水稻、大豆、小麦等一系列的突变体材料；以养分高效优异种质为亲本的重组自交系群体、近等基因系材料；分子标记遗传图谱等。