实验八细菌生长曲线的测定及
血球计数板测定微生物生长
一、细菌生长曲线的测定及
★细菌的生长曲线就是把一定量的菌体细胞接种到恒容积的液体培养基中，在适宜的条件下进行培养，在此过程中，其细胞数目将随培养时间的延续而发生规律性的变化，如以细胞数目的对数值(或O.D.值)为纵坐标，以培养时间为横坐标作一条曲线，即为细菌的生长曲线，它反映了细菌的群体生长规律。

★大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。

★依据其生长速率的不同，可把细菌的生长曲线划分为延滞期，对数期，稳定期和衰亡期等四个时期。

★微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。

通常400～700nm 都是微生物测定的范围，505nm测菌丝菌体、560nm测酵母、600nm测细菌。

★本实验测定细菌生长曲线的方法是，将待测菌种接入一只大试管的培养液中，在适宜的培养温度和良好的通气状态下，定时取出此试管，在600纳米波长处测定菌液浓度(O．D．值)，在一定的范围内，菌液浓度与光密度值成线性关系。

因此，根据菌液的O．D．值可以推知细菌生长繁殖的进程。

将所测得的一组O．D．值与其相应的培养时间作图，即可绘制出该菌的生长曲线。

☆实验操作
1、菌种培养：取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液（LB）中，静止培养12--14h，备用。

2、制备LB培养基100ml置于200ml三角瓶内，备用。

3、标记：取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、
4、6、8、10、12、14、16和20h。

4、接种：分别用5ml无菌吸管吸取5ml大肠杆菌培养液(培养12~14h)转入盛有100ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

5、培养：将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、
6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

6、比浊测定：用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行比浊测定。

从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

7、绘制细菌生长曲线：以时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。

二、血球计数板测定微生物生长
★基本原理
血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴。

中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央1mm2面积上刻有400个小方格。

血球计数板有两种规格，一种是将1cm2面积分为25个大格，每大格再分为16个小格(25×16)；另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。

两者都是总共有400个小格。

当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3的体积。

通过对一定大格内微生物数量的统计。

可计算出1mL菌液所含的菌体数。

在血球计数板上，刻有一些符号和数字，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；
1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。

图1 血球计数板的构造
1、盖片；
2、计数室
图2 两种不同刻度的计数板
本方法适用于酵母菌和霉菌孢子的数量测定。

若要测定细菌数量时误差较大。

本法测得的是菌体总数、不能区分是活菌体还是死菌。

★实验操作
1、血球计数板的操作
(1)取清洁的血球计数板，将洁净的专用盖片置两条嵴上。

(2)将酿酒酵母菌在液体培养基上适温培养24-48h，然后将培养液进行稀释，以每小格有3-5个酵母菌为宜。

(3)摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，从盖片的边缘滴一小滴(不宜过多)，使菌液自行渗入平台的计数室。

加菌液时注意不得使计数室内有气泡，两个平台上都滴加菌液后，静置约5min 。

在低倍镜下找到方格网后，转换高倍镜进行观察和计数。

2、计数方法
(1)不同规格的计数板的计数方法略有差异。

16×25规格的计数板，需要按对角线方位，计算左上、左下、右上和右下4个大格(共100小格)的酵母菌数。

若是25×16规格的计数板，除统计上述4个大格外，还须统计中央一大格(共80小格)的酵母菌数。

酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即可作为两个菌体计数。

位于两个大格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数。

(2)每个样品重复计数2-3次(每次数值不应相差过大，否则重新操作)，取其平均值。

(3)按下述公式计算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数。

①16×25规格的计数板：
酵母菌细胞数/ml ＝100个小格内酵母100细胞数
×400×10000×菌液稀释倍数
②25×16规格的计数板：
酵母菌细胞数/ml ＝80个小格内酵母80细胞数
×400×10000×菌液稀释倍数。