猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究*朱秀萍1，蒋伟娟2，艾晓杰1，徐动1，朱淑文11上海交通大学农业与生物学院，上海 (200240)2上海市兽医卫生监督所，上海 (200335)E-mail：xpzhu@摘要：本研究对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究。
结果显示，用盲吸法去核，体外成熟培养（IVM）39-41h组卵母细胞去核率与IVM 36-38h组差异显著（P<0.05），与42-44h 组差异不明显（P>0.05），但三组显著高于IVM45-48h组（P<0.05）。
化学诱导法去核结果表明，IVM 42-44h组去核率最高，但与IVM 39-41h组差异不显著（P>0.05），其他各组间均差异显著（P<0.05）。
在相同的体外成熟培养时间内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高。
本实验证明：猪卵母细胞IVM在39-44h内去核率较高，且盲吸法去核效率高于化学诱导去核。
关键词：猪卵母细胞，盲吸法去核，化学诱导去核，去核率中图分类号：Q 968.11 前言近年来，体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠，为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。
卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一，卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。
去核效率的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。
因此掌握卵母细胞体外成熟时间，快速而准确的去核，对提高去核成功率有重要意义。
目前动物克隆中普遍使用是机械去核法（盲吸法），该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。
如何既能完全去掉卵母细胞的核，又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。
“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞，用脱羰秋水仙碱（DC）处理激活的卵母细胞，使染色体和极体牢固结合，然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞，成功得到克隆小鼠[1~3]。
Yin等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。
在我国，杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5]，但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。
本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核，旨在确定最佳的去核时间；建立猪卵母细胞化学诱导去核方法；同时，通过两种方法的去核效率的比较，为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。
2 材料和方法2.1 猪卵母细胞的采集实验所用卵巢均来自于上海市闵行区纪王镇屠宰场屠宰的初情期前小母猪。
将获取宰场屠废弃的猪卵巢，置于37℃灭菌生理盐水中，2h内送回实验室。
以生理盐水清将卵巢洗两次*本课题得到上海市科委国际交流项目（015407005）的资助。
后，用剪刀在卵巢门部剪一个V字型口，轻轻挤出其中的血液，然后用带12号针头的5mL 注射器抽取卵巢表面直径为2~6mm卵泡中的卵母细胞-卵丘复合体。
静置15min后，在体视显微镜下选择有3层以上致密卵丘细胞及均匀细胞质的卵母细胞为供试卵。
2.2 卵母细胞的体外成熟培养将卵母细胞在NCSU-37培养液中洗3次，然后移入成熟培养液（NCSU-37）中，每个培养小滴内放15~20枚卵母细胞。
在5%CO2、38.5℃及饱和湿度条件下体外成熟培养[6]，前21~22h体外培养液中添加1000 IU/mL PMSG（宁波生物制品有限公司生产，批号：040520）和1000 IU/mL hCG（宁波生物制品有限公司生产，批号：20030118)、100mmol/L二丁酰环腺苷酸（dbcAMP，Sigma产品，批号：D-0627）；后24h不添加激素和dbcAMP。
2.3 卵母细胞去核卵母细胞的成熟培养分成36~38h、39~41h、42~44h和45~48h四个时间组；将不同时间成熟培养的卵母细胞放入PBS液中轻轻吹打，去除卵丘细胞。
盲吸法去核：将去除卵丘的卵母细胞在含5µg/mL CB浓度的NCSU-37培养液中孵育30min，再用盲吸法去核。
化学去核：将去除卵丘的卵母细胞移入含DC（4µg/mL）的培养液中培养1h，然后在含有DC（4µg/mL）、CHX（50µg/mL）的培养液中培养12h。
Hoeschest33342染色：将去核后的卵母细胞放入含5×10-3g/mL Hoechst33342的培养液中染色15min，在荧光显微镜下检查去核效率；以胞质中无荧光物且细胞完好者为去核完全的卵母细胞。
2.4 不同激活剂预激活的化学性去核将体外成熟培养36h的猪卵母细胞，分别用7％乙醇、10mg/L CB、0.1mmol/L的CaCl2预激活5min，并设不添加激活剂的卵母细胞为对照组，将卵母细胞在含4µg/mL DC的培养液中培养1h后，移入含DC（4µg/mL）+CHX（50µg/mL）+培养液中培养12h，观察不同激活剂处理的去核率。
2.5 数据处理数据采用ANOV A分析，Ｆ检验。
3 结果3.1体外成熟时间对盲吸法去核效率的影响不同时间成熟培养的卵母细胞用盲吸法去核，荧光检测去核效率见表1。
结果表明：IVM 39~41h 组去核率最高，与 IVM 36~38h组差异显著（P<0.05），与42~44h两组差异不明显，但三组显著高于IVM 45~48h组（P<0.05）。
在操作过程中吸入过多胞质，或导致卵母细胞质膜破裂、胞质外流，造成卵母细胞损伤（见图1），均计为操作失败。
表1 不同成熟培养时间猪卵母细胞盲吸法去核效率（n=5）Table 1 The efficiency of different maturation times of porcine oocytes by physical enucleation组别卵母细胞（枚）去核卵母细胞（%）(60.82%)a36~38h卵母细胞去核138 84(67.89%)b39~41h卵母细胞去核169 115(63.53%)b42~44h卵母细胞去核101 64(49.07%)c45~48h卵母细胞去核108 53 注：同一列数据上角标注字母不同者差异显著（P<0.05），下同。
3.2体外成熟时间对化学诱导去核法去核效率的影响体外不同时间成熟培养的卵母细胞经DC和DC+CHXM处理后，去核率不同（见表2）。
IVM 36~38h、39~41h、42~44h和45~48h的去核率分别为44.09%、55.58%、58.12%和36.12%。
IVM 42~44h 去核率最高，但与IVM 39~41h的去核率差异不显著（P>0.05），与其他各组之间差异显著（P<0.05）。
荧光显微镜观察去核卵母细胞（见图2）。
表2 不同成熟培养时间猪卵母细胞化学诱导法去核效率（n=5）Table 2 The efficiency of different maturation times of porcine oocytes by chemical-induced enucleation 组别卵母细胞数（枚）去核数（%）36~38h卵母细胞去核144 63(44.09%)b39~41h卵母细胞去核185 102(55.58%)a42~44h卵母细胞去核184 107(58.12%)a45~48h卵母细胞去核174 63(36.12%)c图1 盲吸法操作后损伤的卵母细胞图2 化学去核完全的卵母细胞Fig 1 The injure oocytes by physical enucleation Fig 2 The enucleation oocytes by chemical-induced图3 荧光下正常卵母细胞Fig 3 The normal porcine oocytes3.3 不同去核法去核效率比较盲吸法和化学诱导法的去核效率见图4。
在相同的时间组内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率高。
IVM 42~44h，两种方法的去核率差异不显著。
IVM 36~38h、39~41h和45~48h 两种方法的去核率差异显著（P<0.05）。
说明猪卵母细胞体外培养42~44h，用盲吸法去核和化学诱导法去核都可得到较高的去核率。
图4 卵母细胞盲吸法和化学诱导法去核的去核率Fig 4 The enucleating rate of physical and chemical-induced enucleation in porcine oocytes4 讨论去核率的高低与卵母细胞所处的成熟时期以及所采用的去核方法有密切的关系，因此有必要确定准确的去核时间及采用合适的去核方法来获得较高的去核效率。
目前常规去核方法仍是以PB1位置为去核参照的盲吸法。
化学诱导去核法是一种思路转换的产物，以药物处理来获得去核的受体胞质。
采用以PBl为标志的盲吸法，随着成熟时间的延长，卵龄增加使第一极体与中期染色体的位置发生偏转[7]。
刘东等研究表明，成熟培养36h的卵母细胞的中期染色体在第一极体下方；而成熟培养44h时，部分卵母细胞的中期染色体已远离第一极体[8]。
本实验结果表明，39~41h 的去核率最高，与42~44h的去核率差异不显著。
可见IVM 39~44h之内去核都是较合适的，卵母细胞刚刚排出第一极体，细胞核与极体非常近，此时去核率较高。
显微去核需要高水平的视觉和手动控制，存在着技术要求高、耗费时间长、对细胞损伤大的缺点。
卵母细胞处于39~41h时进行去核，可保证卵母细胞的操作时间，降低卵母细胞的损伤。
施巧婷等报道成熟的卵母细胞细胞核已远离第一极体，逐渐内移，去核率较低[9]。
本研究发现培养45~48h的卵母细胞去核率显著低于另三组，这细胞核远离第一极体，卵母细胞体外培养时间的延长使细胞老化有关。
化学诱导去核法可使卵母细胞去核过程简化，对细胞的物理损伤小、胞质丢失少，实验的重复性好。
本研究通过用两种试剂DC和CHX对猪卵母细胞诱导去核，为提高去核效率，以不同的成熟培养时间来分析化学诱导去核法的去核率。
研究表明在IVM 36~38h、39~41h、42~44h和45~48h时，去核率分别为44.09%、55.58%、58.12%和36.12%。
可见卵母细胞在IVM 42~44h时，去核率最高，但与39~41h组见无显著差异（P>0.05），其余各组间差异显著（P<0.05）。
这与杜卫华等对小鼠卵母细胞不同成熟时间化学性去核的研究一致[5]：卵母细胞完全成熟之前，不同的培养时间，去核率逐渐升高，但随着卵母细胞成熟培养时间的延长，去核率逐渐降低，直到降为零。