怀化医专《微生物学检验》教案编号：10细菌对抗菌药物敏感试验药敏试验(antimicrobial susceptibility,AST)（一）概念：在体外检测药物抑制或杀死细菌能力的试验。

（二）检测意义：1、疾病的治疗：指导用药。

2、耐药菌检测和流行病学调查。

3、评价新药抗菌作用。

4、某些菌种的鉴定。

第一节临床常用的抗菌药物抗菌药物：是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。

一、青霉素类抗生素：青霉素种类抗菌活性1、天然青霉素不产青霉素酶的G+G-球菌、普雷沃菌等。

青霉素G、青霉素V2、耐青霉素酶青霉素产青霉素酶的G+G-球菌甲氧西林、奈夫西林、苯唑西林等3、广谱青霉素青霉素G敏感细菌、大部分大肠埃希菌、氨苄西林、阿莫西林奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等G-菌替卡西林、羧苄西林、氨苄西林无效的G-菌，产β-内酰胺酶美洛西林、派拉西林克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌、厌氧菌二、头孢菌素类抗生素：1、第一代头孢菌素（头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢羟氨苄等）作用：对G+菌作用强，如金葡菌、链球菌等。

2、第二代头孢菌素（头孢羟唑、头孢呋辛、头孢克洛、头孢尼西、头孢雷特等）作用：产青β-内酰胺酶G-菌有作用，如肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌等。

3、第三代头孢菌素注射用头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢派酮：对产青β-内酰胺酶G-菌有很大抗菌活性。

口服用头孢克肟、头孢布坦等：对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无用。

4、第四代头孢菌素（头孢匹罗、头孢匹美）作用：对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌作用强。

三、其它β-内酰胺类抗生素：1、单环β-内酰胺类抗生素（氨曲南、卡芦莫南）对G-菌作用强2、头霉素类：对G+菌、厌氧菌作用较好氧头孢烯类抗生素：抗菌谱广，对产β-内酰胺酶G-菌作用强，对产酶的金葡菌有效3、碳青酶烯类抗生素（亚胺培南、米洛培南等）广谱（最广），抗菌活力强4、β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦）与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。

四、氨基糖苷类抗生素：链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星等作用：对需氧G-杆菌有强大抗菌活性对沙雷菌属、气单胞菌属、产碱杆菌、不动杆菌属、分枝杆菌属也有一定抗菌活性。

但对G-球菌效果差。

五、喹诺酮类抗生素：第一代：（新恶酸等）窄谱抗生素（G-）第二代：（环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等）对G+G-菌均有作用。

第三代：（斯帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等）超广谱抗生素。

六、大环内酯类抗生素：红霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素等作用：和青霉素相似，主要是G+菌、厌氧菌。

新一代：克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、阿齐霉素等。

七、四环素、氯霉素、林可酰胺类抗生素：八、糖肽类抗生素九、磺胺类药物及其增效剂药敏试验常规抗菌药物选择：根据NCCLS（National committee for clinical laboratory standars）非苛氧菌和苛氧菌有各自常规药敏试验标准。

在标准中分成ABCU四组——A组：常规首选药，作为一级试验并常规报告的抗生素。

B组：临床使用主要抗生素，在某些情况下使用。

为一级试验，有选择报告的抗生素。

C组：补充试验，有选择报告的抗生素。

用于对A组药物耐药的菌株或过敏的病人。

U组：仅用于泌尿道的补充试验的抗生素。

第二节需氧菌和兼性厌氧菌药物敏感试验一、纸片琼脂扩散法（K-B法）纸片扩散法是一种操作简单，易于掌握的半定量的药物抑菌测定法。

为使结果更可靠，1971年世界卫生组织推荐了Kirby-Bauer(K-B)法作为标准化的药敏方法。

该法要求所需试剂、药物纸片、培养基、菌液浓度以及操作方法都必须标准化，主要适宜于需氧菌和兼性厌氧菌的药敏测定，是目前临床工作中最常用的药敏试验方法。

（一）原理将含有抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板上，纸片中的药物吸收琼脂中水分后向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度，纸片周围的待测菌生长如果被该药物所抑制，就会形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映了待测菌对该测定药物的敏感程度，并与该药对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。

MIC（最低抑菌浓度）：抑制待测菌生长所需要的最小浓度。

（二）材料培养基，抗菌药物纸片，菌液等。

（三）实验步骤（四）影响因素（五）结果判断和报告测量抑菌圈直径，作出判断。

敏感（sensitivity）：待测菌株在体内可被常规剂量的测定药物抑制或杀灭。

中度敏感（morderate sensitivity）：指通过提高药物浓度或在该药生理性浓集部位，细菌生长可被抑制。

中介度（intermediate）：为“缓冲域”，以防止由技术因素失误导致的结果偏差。

不能作为临床报告。

耐药（resistant）：待测菌株不能被常规剂量的抗生素所抑制。

（六）质量控制1、质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853，粪肠球菌ATCC 29212或33186。

2、抑菌圈质控范围：各种抗菌药物对以上4种质控菌株的抑菌圈允许范围为95％可信限。

（即：实验室日间质控得到的抑菌圈直径在连续20个数值中仅允许1个超出范围）见P134表15－1二、稀释法为定量法，体外检测某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）值。

根据稀释培养基不同，分为：肉汤稀释法和琼脂稀释法。

（一）肉汤稀释法1、原理：用M-H液体培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）2、材料：抗菌药物原液，M-H液体培养基，菌液等3、步骤：稀释药物→加菌液，混匀→培养，检测结果注：每种药物稀释的浓度范围见P137页表15－44、结果判断：以肉眼观察无菌生长的最低药物浓度为该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。

再以0.01ml容量接种环从肉眼观察无菌生长的试管中取一环接种于血琼脂平板作次代培养，经35℃培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9％原始种入的细菌即为最低杀菌浓度（MBC）。

（二）琼脂稀释法1、原理：将待测菌接种于含有不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。

2、结果判断：以无菌落生长的最低药物浓度为该药对待测菌的MIC。

3、质量控制：标准菌株同前。

方法评价：本法的优点是可同时进行多株细菌的MIC测定，结果较液体稀释法可靠，且易于发现污染或耐药交叉菌株，为开发新药的体外药敏试验常用的参照标准；缺点是制备药物琼脂平板时费时费力。

三、联合药敏试验在制药工业中，为了得到抗菌增效的配方，常进行两种或两种以上抗菌药物复方制剂的筛选。

中成药也有配方中含多种抗菌药物的情况。

更重要的是在临床上，对于尚未确定由何种病菌引起的急、重症感染以及由多种细菌混合感染的治疗，常采取联合用药，以此获得较理想的疗效。

1、联合药敏试验的意义：（1）治疗混合性感染或未确定病原菌的急、重症感染（如败血症）；（2）预防或推迟细菌耐药的发生；（3）联合用药可以减少剂量避免达到毒性剂量；（4）联合用药比单一用药效果更好。

2、联合药敏试验的结果与类型（1）协同作用：两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。

（2）相加作用：两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和。

（3）无关作用：两种药物联合作用时的活性等于活性最大的抗菌药物的药效。

（4）拮抗作用：两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性。

3、联合药敏试验的方法（1）扩散法：（定性）如：单药纸片搭桥法，纸条扩散法。

（2）稀释法：（定量）棋盘法——是目前常用的定量联合抗菌试验法，由两种抗菌药物的不同稀释度加以组合，每一种药物浓度都有单独的和另一种药物不同浓度的联合，能精确测定出两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用，因其排列呈棋盘状而得名。

由于使用的培养基不同，又分液体棋盘稀释法和琼脂盘稀释法。

四、E试验是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。

原理：E试条是一条5×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先准备的、浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。

抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判别有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。

将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。

第三节细菌耐药性检查方法一、细菌耐药性表型检测（一）琼脂筛选试验：以单一药物单一浓度检测细菌的耐药性，常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐庆大霉素或链霉素的肠球菌。

（二）折点敏感试验：仅用特定抗生素浓度（敏感、中介、耐药折点MIC）测定细菌对药物的敏感性。

（三）双相纸片试验：是非NCCLS规定ESBL检测方法。

方法：挑取在血平板上生长的细菌菌落，稀释成0.5麦氏比浊管浓度，均匀涂布于M-H平板，中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片25mm处（中心－中心）分别贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻污、氨曲南等纸片作为指示剂，35℃孵育16～18h，若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待测菌产生超广谱β－内酰胺酶（ESBL）。

（四）自动化仪器二、β－内酰胺酶检测1、头孢硝噻吩滤纸片法用接种环挑取待测菌菌落于商品化头孢硝噻吩滤纸片上，于10min内由黄色变为红色即（＋）。

2、碘淀粉测定法待测菌落＋青霉素溶液→室温振摇30min＋淀粉＋碘液→溶液变蓝→继续振摇，10min内变为无色为（＋）。

三、其它：耐药基因检测，特殊耐药菌检测第四节体外抗菌试验的影响因素体外抗菌试验受培养基、试验细菌、药物本身以及其它因素的影响。

试验时，只有严格控制试验条件，才能保证实验结果的准确性，重复性及科学性。

一、培养基的成份尽量使用成份较简单的培养基，培养基中应避免含有药物的干扰物质和拮抗物质，如钙、镁离子可以降低氨基糖苷类药物的抗菌活性；胸腺嘧啶核苷和对氨基苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性，目前大多使用M-H培养基。

二、培养基的PH培养基的PH值应在7.2-7.4之间，太酸或太碱不仅会直接影响细菌的生长，更重要的是还影响药物的抗菌活性。

培养基的PH值可以改变药物的离子化程度而影响药物渗入细胞内。

一般情况下，非离子化的物质比离子化的物质更易进入细菌壁和细菌膜。

三、试验菌的菌种及菌量试验菌种必须是标准菌株，如金黄色萄葡球菌ATCC 25923，大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853及粪肠球菌 ATCC 29212等。