8.重复操作步骤7。
9. 12,000 rpm离心2 min，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10.将吸附柱CB3转入1.5 ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min
【实验方法】：
1.处理血液材料（已添加抗凝剂的1 ml血液样品）：
在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000 rpm离心1 min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入4μl RNase A（100 mg/ml）溶液，振荡15 sec，室温放置5 min。
【作业要求】：
认真完成实验报告并对结果进行分析讨论。
【时间安排】：
实验内容及结果在学生操作前及操作中的穿插讲解40min
实验操作（学生一人/分组完成）155min
实验基因组DNA提取试剂盒：细胞裂解液CL、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱缓冲液TB、ProteinaseK、吸附柱CB3、收集管(2 ml)、1.5 ml离心管
【实验内容】：
1采用血液基因组DNA提取试剂盒利用酚抽提法提取人外周血细胞基因组DNA
【实验原理】：
酚抽提法提取DNA
12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
3使用缓冲液GD、漂洗液PW前请先检查是否已加入无水乙醇。
4必须将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
5洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。
6酚的腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，应在化学通风橱中进行操作并且必须穿戴手套、防护镜及防护衣。与酚接触过的皮肤，应使用大量的水清洗，并用肥皂与水洗涤，忌用乙醇。
（1）分离提取DNA首先应分离出白细胞。将分散好的细胞用含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的细胞裂解缓冲液进行裂解。EDTA为二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶的活性使DNA完整的溶解在溶液中并降低细胞膜稳定性的作用。SDS作为生物阴离子去垢剂，在降解细胞膜、乳化脂质和蛋白质中起重要作用。无DNA酶的RNA酶通过有效水解RNA而避免DNA的消化。（2）随后加入蛋白酶K用于水解蛋白质，消化DNA酶及DNA上的蛋白质。（3）再用Tris酚反复抽提，因为酚作为蛋白质的变性剂，使蛋白质变性溶于有机相，DNA保留在水相。Tris缓冲液能确保抽提后的DNA进入水相，从而避免其滞留于蛋白质层。重复抽提有提高DNA的纯度的作用。一般抽提三次后，便可移出含DNA的水相，用于沉淀处理。（4）沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀以去除残留的有机溶剂，并用70%的乙醇洗涤去盐，得到较纯净的基因组DNA。
11.DNA浓度及纯度检测琼脂糖凝胶电泳
核酸是两性电解质，其等电点为pH2.0～2.5左右，在常规的高于其等电点pH值的碱性缓冲溶液中带有负电荷，在电场中向正极移动。被分离的核酸分子在电场中的迁移率与凝胶浓度、被分离核酸分子的大小及构型、所加电压的高低、电泳缓冲液的组成及其离子强度等因素的影响。
【实验结果】：
【注意事项】：
1对于高分子量DNA的制备，由于受剪切力的影响很大，每一步的操作都要特别小心、温和，避免激烈的吸取、振荡与混匀。
2加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般37℃放置时会消失，不会影响后续实
验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不
纯。如果裂解不彻底，需要延长裂解时间或重复裂解。
教具与课件：
板书
课外作业：
1．复习人外周血细胞DNA分离与纯化酚抽提法的原理。
2．完成实验报告并对结果进行分析。
课后回忆（经验教训、效果估计或反应，存在问题……）：
系（教研室）主任
年月日
教学内容与组织安排：
人体外周血细胞基因组DNA的分离与纯化
【目的要求】：
1掌握人血白细胞DNA分离与纯化的原理和方法。
2.加入20μl Proteinase K溶液，混匀。
3.加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10 min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。
4.加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），
学院检验学院系（教研室）病原生物与分子生物检验教师姓名刘二强
课程
名称
临床微生物学与检验
专业
层次
临床检验
年级
授课
方式
实验讲授
授课
时间
学时
授课题目：
人体外周血细胞基因组DNA的提取
目的要求：
掌握:人体外周血细胞基因组DNA提取的原理和方法。
重点难点：
重点：试剂盒提取DNA的原理
难点：人外周血基因组DNA酚抽提方法