徐珏2011.12.3 17:59 于苏州宝石御景园目录标准探测模式（DU4）图像拍摄流程 (1)一、软件开启 (1)二、基本设置 (2)[A1 Setting]界面主要功能区域简介 (2)[Setting]界面功能简介 (4)[Filter and Dye]功能区简介 (6)串色现象解释及Line模式图解 (6)Line模式图解 (7)[scan setting]功能区简介 (7)三、获得图像 (8)[Acquisition]功能区简介 (10)放大方式选择按钮简介 (13)图片扫描参数调用简介 (17)JP2格式图片转化为JPG/TIFF格式图片的操作 (18)各通道荧光图像自由叠加的介绍 (18)数据分析 (21)一、ROI区域分析 (21)二、LUTs调节图像荧光亮度 (23)三、去背景 (25)四、标尺添加 (26)六、长度面积等常规测量 (28)七、细胞计数 (28)[Binary Toolbar]界面简介 (32)光谱扫描模式（SD模式） (34)一、SD模式基本设置 (34)[Detector]标签页功能简介 (35)[Binng/Skip]标签页简介 (36)二、图像获得 (37)三、数据分析 (39)[Spectrum Profile]视窗简介 (40)四、光谱拆分 (40)虚拟滤光扫描模式（VF模式） (47)一、VF模式基本设置 (47)[Detector]设置标签页简介 (48)[Gating Setting]标签页简介 (48)二、获得图像 (48)时间序列拍摄 (49)[Capture Timelapse]视窗简介 (49)[ND]界面简介 (51)[Time Measurement]界面简介 (53)[Capture Z-series]视窗简介 (55)拼大图拍摄 (60)光活化序列拍摄 (61)[Photo Acquition]功能区简介 (62)[Sequential Stimulation]界面简介 (63)常见细胞类型和细胞器形状 (65)常用荧光染料及应用领域 (68)标准探测模式（DU4）图像拍摄流程一、软件开启1、双击桌面NIS-Element图标。
2、出现对话框后，选择[Nikon A1/C1 Confocal]，点击OK按钮。
3、出现NIS启动窗口，软件与硬件通讯开始建立，此过程将持续5-10秒或者更长，请耐心等待。
通讯建立后，自动出现NIS-Element操作主界面。
二、基本设置4、鼠标右击操作主界面空白处，在[Acquisition Controls]中选择[A1 Settings]，出现激光模式设置界面（A1 setting）。
[A1 Setting]界面主要功能区域简介：5、根据实验情况设置光路，点击[Filter and Dye]功能区中的[Setting]按钮，打开详细的光路设置界面（Setting）。
[Setting]界面功能简介：6、点击[OK]按钮回到[A1 Setting]界面，由于[Setting]界面中光路设置的调整，[Filter and Dye]和[Acqusition]功能区会做出相应的改变。
下图为标准探测模式（DU4）的通道界面。
[Filter and Dye]功能区简介：串色现象解释及Line模式图解：串色：目前的光路设置为一个激光激发样品产生的发射光只对应一个接收通道，则当同时有两种及以上激光激发样品时，如一种或多种激光激发的发射光在多个通道均可检测到，将导致测试结果的不正确。
Line模式图解：一个方格为一个像素点，一行为扫描的一条线。
7、在[A1 Setting]界面的[scan setting]功能区设置扫描参数，扫描参数在扫描过程中也应根据情况进行调整。
[scan setting]功能区简介：三、获得图像8、点击[Acquire]功能区[Live]按钮，开始扫描，主界面出现扫描图像[Live]视窗，视窗中功能键介绍见数据分析章节。
鼠标滚轮前后滑动，调整焦距以找到荧光强度最大的焦平面，得到亮度最高的扫描图像。
图像在标准探测模式（DU4）下获得，注意下方通道标签和[Filter and Dye]功能区探测器类型和色彩的一一对应关系。
[All]标签页为所有通道图像全部叠加到一起后的图像；色彩标签页为所对应探测器通道的图像。
[TD]标签页为激光明场图像；[Custom]标签为自定义标签，鼠标右击custom标签，点击属性，可选择两个或几个所需要通道进行叠加得到所需要的图像；右击色彩通道标签，选择属性，还可改变通道色彩。
9、扫描图像亮度调节。
荧光亮度应处在一个合适的范围，既不能太低使画面显得模糊，也不能太高使画面曝光过度，同时希望背景干净，随机噪声少；因此需要对图像的荧光亮度进行调整。
在Live状态下，[Acquisition]功能区通过调整PMT探测器增益（HV）,激光发射功率（Laser）和针孔（pinhole）大小改变扫描图像亮度。
[scan setting]功能区也应配合调节，但必须在Frozen 状态下进行，否则会对扫描头造成严重损害！[Acquisition]功能区简介：10、Frozen 状态在[Live]视窗状态下，再次点击[Acquire]功能区[Live]按钮，图像的[Live]视窗变为[Frozen]视窗，即结束扫描，画面定格。
在Frozen 状态下，可实现多种程序操作，如拍摄，设置[Scan Setting]功能区参数，光路设置，图像放大框确定等，这些操作不可在[Live]状态下进行，会对扫描头造成损害。
11、图像数码放大功能的实现在物镜不变的情况下，通过软件设置也能得到当前扫描图像的放大图像。
（1）点击[Live]界面的放大按钮，得到图像放大框。
点击[Live]界面右击[Scan Area]按钮，或在主界面空白处，在[Acquisition Control]中选择[Scan Area]，得到扫描区域视窗（Scan Area），也可实现相同功能，在[Scan Area]视窗中还可实现放大倍数的设置。
放大方式选择按钮简介：方形放大长方形放大线扫描剪切Scan Area消除放大区域（2）在Frozen状态下，确定放大或剪切区域，右击该区域使画框变为绿色；点击[Live]按钮，得到放大了的扫描图像或剪切后的扫描图像。
A．正方区域旋转后得到的的放大图像。
B．方形区域得到的放大图像C ．点击[Frozen]视窗上的[Edit]按钮，出现ROI 绘图选择框。
在图像上选择需要的区域后，[Finish]确定，点击[Live]扫描得到选中区域的剪切图像。
12、[Ti Pad]界面的功能显微镜主体的型号为Ti，因此[Ti Pad]界面的功能是在软件中控制显微镜的硬件的转换，如物镜的切换，物镜的位置，PFS的开关，白炽灯的打开和亮度，汞灯滤光片的切换等，这些转换同样可以在显微镜主体和外部控制设备中实现。
13、图像的拍摄和保存通过焦距调节，亮度调节，扫描区域放大或剪切操作后，得到了实验需要的图像。
接下来将把图像拍摄下来保存，或进行下一步的数据分析。
（1）在Frozen状态下，点击XY按钮。
（2）得到captured图像，保存图像到目标文件夹并编写文件名，保存格式为JP2格式。
图片扫描参数调用简介：JP2格式图像包含了图像拍摄时的各种参数，右击图片打开[Image Properties]界面，可查看拍摄参数，包括物镜类型，激发光，激发光输出功率，接收通道，增益，补偿，扫描速度，图像分辨率，放大倍数等信息。
如需调用图像拍摄参数，右击图片选择[Reuse Camera Setting]，即可在主界面重置扫描参数。
JP2格式图片转化为JPG/TIFF 格式图片的操作：JP2格式图片包含了所有接收通道的荧光图像，因此转化为JPG/TIFF 格式图片时，需要对每个接收通道的图像分别进行转化。
（1） 选择需要转化的图像（2） 点击通道标签选择需要的接收通道图像 （3） 输入[Shift+Z]，出现一张截图。
（4） 保存截图至文件夹，格式选择JPG/TIFF ，并填写文件名。
（5）继续选择并转化其他接收通道图像。
各通道荧光图像自由叠加的介绍：前文介绍了在Live/Frozen 状态下用[Custom]通道标签得到可各通道自由叠加的荧光图像。
现介绍可实现此功能的另一种方法：（1）Frozen 状态下，点击一通道标签，拖曳至主界面空白处，出现一张单通道荧光图像； （2）点击另一通道标签，拖曳至单通道荧光图像界面，即形成两个通道叠加的荧光图像。
（3）继续第（2）步操作即可得到需要的叠加荧光图像。
[TD]通道也可参与通道叠加。
14、两种激光一种接收通道（2Ex1Em ）的光路设置在有些实验设计中，样品加入两种荧光染料，分别受激于不同的激发光，但两种染料的发射荧光在同一个波长区域。
可以通过先用一种激光扫描样品得到染料1荧光图像后，再用另一种激光扫描样品得到染料2的荧光图像的方法实现实验目的，但方法太过繁琐。
我们可以利用程序中的2Ex1Em模式方便的对两种染料进行同时扫描并得到分离的荧光图像。
（1）打开[setting]界面，选择2Ex1Em模式（2）选择发射荧光接收通道和激发光（3）点击Live按钮，出现扫描图像。
色彩标签页为不同激发光在同一个通道中的荧光图像，可根据需要更改荧光色彩加以区分。
数据分析一、ROI区域分析当需要在图像中选取特定区域进行荧光分析时，可通过ROI绘图工具实现。
1、点击ROI绘图工具按钮，在下拉菜单中选择区域形状，其中[Auto Detect ROI]表示系统自动识别形状，在选择细胞时非常有用，原理是基于相同荧光亮度轮廓的检测。
2、ROI图型绘制后，鼠标右击表示确定，ROI区域会出项数字图标表示选定。
白色ROI 区域为当前活动ROI。
下图中ROI 4区域即为[Auto Detect ROI]绘图工具绘制。
3、[ROI Statistics]界面：右击主界面空白处，在[Analysis Controls]选项中打开[ROI Statistics]界面，界面显示当前活动ROI区域的各种参数，如平均亮度，总面积等。
4、[Automated Measurement Results]界面：点击主界面工具栏图标，打开[Automated Measurement Results]界面，选择[ROI Data],界面图表中显示所有ROI区域的数据信息，可点击[Options]按钮添加或删除显示信息类型;界面右侧直方图显示感兴趣数据信息（下拉菜单中选择）的区域数量分布。
二、LUTs调节图像荧光亮度图像中每个像素点的荧光亮度数值范围为0-4095。
如某个像素点的真实荧光亮度大于4095，属于曝光过度，图像中实际显示荧光亮度只能达到4095，有时会影响实验结果，如图像中曝光过度的像素点过多，应调节扫描参数降低荧光亮度。