Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997–15002
Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599–611
能量共振转移制备荧ຫໍສະໝຸດ 呼吸囊泡精品课件B) Schematic representation of the protonation and deprotonation of PEG-b-PDMA-Azo in the C) Steady-state fluorescence spectra of the vesicular solution at pH values between 4 and 12 D) Reversible pH-induced change in the fluorescence
能性小，荧光强） ④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至猝
灭）
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荧光强度与环境因素的关系
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有序介质的影响(表面活性剂)
CMC
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Intensity
1500000
1000000
500000
0 350
0.0001 0.0005 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5 1 mg/ml
Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:1395–1398
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Thank you very much
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荧光光谱的原理及其在分 子自组装中的应用
郑永丽 上海交通大学化学化工学院
20131115
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主要内容
概述 荧光光谱法原理 荧光的光谱特性 我们有关荧光的工作
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概述
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基本概念 能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的，因 此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回
Intensity
图称为荧光的激发光谱。
图 荧光染料C-540A
250000
发射波长的：激发固和定发激射发光谱光的波长而不断改变荧光的测定波长
并记录相应的荧光强度，所得到的0 荧光强度对发射波长的谱
图则为荧光的发射波长。
400
500
600
700
Wavelength / nm
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基本概念
测试方法：
磷 光 模 块
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荧光寿命模块
图 荧光分光光度计的光学系统
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两亲性超支化聚合物分子自组装
HBPO-star-PEO
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荧光光谱法研究内容
聚合物CMC的测定 荧光猝灭法测量分子的分布 能量共振转移制备荧光呼吸囊泡 荧光偏振测量分子的流动性 荧光寿命研究体系微环境 发光聚合物荧光性能的测定
测试方法：
①时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting , TCSPC); ② 相调制法(Phase Modulation Methods) ③频闪技术(Strobe Techniques).
应用：
荧光寿命与物质所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此 可以通过荧光寿命直接了解所研究体系发生的变化。
常用偏振研究的荧光分子：
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘 磺酸钠(2,6-ANS)
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荧光共振能量转移(FRET)
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基本概念
定义：
当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱与 另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor） 的激发光 谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧 光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
58
Rhodamine 101
100
Rhodamine 6G
95
Rhodamine B
31
Tryptophan
13
L-Tyrosine
14
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Conditions for Measurement
PBS PBS Methol 0.1M NaOH, 220C Cyclohexane 0.1 M H2SO4, 220C Ethanol Water
供体分子的发射态偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、以及它们的向 量必须满足一定的条件
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应用
检测两个发光分子间的重合与共定位 检测分子间的相互作用 检测分子的折叠与构象变化
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供体-受体荧光分子对
染料类(Dye)
FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5
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常用荧光探针
探针 1,8-ANS
Ex(nm) Em(nm)
372
480
Hydroxycoumarin 325
386
探针 Cy3 Hoechst 33342
Ex(nm) Em(nm)
550
570
343
483
Aminocoumarin
350
445 Ethidium Bromide 493
620
温度，溶剂，激发波长，浓度
应用：
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系 间跨越、外转移和内转移等的相对速率
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常用物质的量子产率
Q.Y. Standards
Q.Y. [%]
Cy3
4
Cy5
27
Cresyl Violet
53
Fluorescein
95
popop
97
Quinine sulfate
Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395
Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633
到基态所发出的辐射。 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的
辐射。 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )：
又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强 度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行的定性分析．
Water Water, 200C
Water
Excitation [nm]
540 620 580 496 300 350 450 488
514 280 270
荧光偏振
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基本概念
定义： 测量：
①L-型或者单通道法 ②T-型多通道法
应用：
流动性,分子基本性质,酶学 分子相互作用,荧光偏振免疫,成像
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荧光寿命的计算
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荧光测试技术
同步荧光测定；导数荧光测定；三维荧光光谱技术 时间分辨荧光测定；相分辨荧光测定； 荧光偏振测定；荧光免疫测定； 低温荧光测定； 固体表面荧光测定； 近红外荧光分析法； 荧光反应速率法 荧光显微与成像技术；空间分辨荧光技术荧光探针技术；单
分子荧光检测技术； 荧光光纤化学传感器
400
450
Wavelength (nm)
荧光量子产率
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基本概念
定义：
荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的 光子数之比值.(Y)
测试方法：
①参比法 Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au ) ·(nu/ns)(A<0.05)； ②直接测量法，要求仪器有积分球
注意事项：
NBD
466
536 Fluo-3 (膜穿透性) 506
526
Fluorescein
495
519
DPH
362
432
Rhodamine B
570
590
EGFP
488
507
Alexa Fluro 350
343
442
Calcein
496
517
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我们有关荧光的工作
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荧光稳态模块
系统总图
显微荧光模块
1)判断激发波长：①根据分子结构判断；②参照吸收光谱； ③三维扫描
2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长 3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长
强度：
比尔-朗伯定律 If=2.303YfI0εb c
应用：定性和定量
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荧光波长和强度与结构的关系
①跃迁类型（pi->pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强） ②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强） ③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活可