摘要和哺乳动物的免疫球蛋白比较，就现实而言鸡的免疫球蛋白更有优势。

这个研究中，两个质粒被构建用来来自一个鸡的杂交体重组鸡免疫球蛋白的表达。

首先是轻链的表达，和在羧基末端用组氨酸标记的重链的表达。

在重组体鸡免疫球蛋白基因转染到中华仓鼠卵巢细胞之后，就可以选择出一个可分泌特定抗体指定的HF33的转染体。

HF33细胞能以每天每106个细胞产生10~15mg的带有组氨酸标记的免疫球蛋白。

在Western免疫印迹分析中，重组的免疫球蛋白由于一条H链的条带和两条L链的条带而被检测到。

这个重组免疫球蛋白在一个利用？？步骤中被成功的纯化。

这些结果显示，目前的重组鸡卵黄抗体对进一步的应用是有作用的。

2005，国际生物组织，由Elsevier Ltd 出版。

关键词：重组抗体；鸡；免疫球蛋白Y，CHO1.引言鸡卵黄抗体在各种免疫反应中更有于哺乳动物的免疫球蛋白，因为它不和蛋白A，蛋白G以及类风湿因子反应。

进一步讲，它不激活哺乳动物的免疫系统，这个免疫系统可以在酶联免疫吸附试验中对减少血清标本干扰酶的方面更突出。

免疫球蛋白Y抗体已被证明在诊断、异种移植和抗生素替代疗法等应用中更有优势。

我们最近利用细胞融合技术和噬菌体表面表达技术生产出大量的可以识别阮病毒的鸡单克隆抗体，我们还生产出chickenehuman嵌合抗体。

尽管单克隆抗体的使用导致了广泛的研究领域的巨大进展，杂交鸡抗体生产水平相对较低。

这样的生产水平低，适合实验室使用，但严重地限制了鸡单克隆抗体的潜在的工业应用。

保守的哺乳动物分子已知少通常用于immuni - zation用于哺乳动物的免疫原性。

另一方面，鸡在对于这些蛋白的特异性抗体的发展是有益的，因为它位于不同于哺乳动物进化树的分枝，有更高的抗体生产潜力。

例如，在不使用朊蛋白基因敲除的小鼠时，很难产生对哺乳动物朊蛋白单克隆抗体分子，因为在哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列同源性超过84％。

一步纯化鸡卵黄抗体是不容易的，因为鸡卵黄蛋白抗体并不和蛋白A或蛋白G结合，和哺乳动物免疫球蛋白比较，它在酸性或碱性条件下更敏感。

在简化纯化和增加免疫球蛋白产量努力中，我们尝试用组氨酸标记来构建两个质粒以表达重组鸡卵黄抗体。

用镍亲和层析柱可一步纯化的重组免疫球蛋白，产生于培养的哺乳动物细胞。

在这里，我们显示了重组鸡卵黄抗体的作用。

2.材料和方法2.1.细胞和介质中国仓鼠卵巢（CHO）细胞于37摄氏度5%的二氧化氮下保存在含有10％胎牛血清的F12 介质中。

鸡杂交瘤细胞，HUC2 - 13 [11]，它可以产生特定朊蛋白抗体，在38.5摄氏度5%的二氧化碳下保存于在Iscove的修订贝科的含10％胎牛血清介质中。

2.2.cDNA的合成根据制造商的指示，使用Isogen- LS型（日本大学，日本）协议，总RNA是从HUC2 - 13杂交瘤细胞中提取的。

cDNA的第一条链是用12-18个寡聚T的引物来合成的。

2.3.轻链基因的克隆编码鸡卵黄球蛋白抗体轻链的DNA片段可用KOD DNA聚合酶通过PCR扩增，使用HUC2-VLF3(5#-A TA TA TAAGCTTGCCA TGGCCTGGGCTCCTCTCCT-3#)和HUC2-VLR1(5#-TCTCTAGA TTAGCACTCGGACCTCTTCAG-3#)作为引物，以合成大小的cDNA 作为模板。

这些引物包含有HindIII and XbaI的限制性酶切位点，可以退火到头部的氨基末端区域和位于IgY轻链基因的C1的羧基末端区域。

扩增的PCR片段可以被HindIII and XbaI 处理，然后插入到pBluescript II SK相同的位点。

这些克隆片段的序列就可以根据已知的HUC2-VLF3和种系的序列确定出。

这些轻链基因片段再次用HindIII and XbaI处理，然后连接到位于表达载体的人居细胞病毒下游的相同位点上。

这些表达蛋白既没有组氨酸标记，也没有myc基因表位，因为PCR 片段包含有一个终止密码子。

2.4.重链基因的克隆编码重组IgY重链的DNA片段可以用Taq DNA聚合酶的PCR产生，在GC buffer中使用HUC2-HF4(5#-TTGGTACCACCA TGAGCCCACTCGTCTCC-3#)andHUC2-HR4(5#-TTACCGGTTTTACCAGCCTGTTTCTGCAG-3#)作为引物。

这些引物包含有KpnI or PinAI的限制性酶切位点，可以退火到头部的氨基末端区域和位于IgY重链基因的羧基末端区域。

每个基因扩增片段利用QIA快速纯化试剂盒通过琼脂糖凝胶回收并且通过KOD DNA聚合酶的PCR再次扩增。

这些片段用ＫｐｎＩ处理，然后插入到具有KpnI and HincII 位点的pBluescript II SK，这些序列就被确定为轻链。

这些来自质粒的基因片段再次用KpnI and PinAI处理然后连接到pcDNA4/myc-His A表达载体启动子下方的相同位点。

2.6.ELISAELISA法进行如前所述。

过氧化物酶标记羊抗鸡lgG，或碱性磷酸酶标记羊抗鸡IgG中被用于检测。

Supernatant从106跨fectant后收集细胞培养24用于H遭到to170吨。

岛本等/生物制品33 169e174ELISA，以确定重组IgY.A小鼠单克隆抗体针对H链鸡卵黄抗体的生产水平被用于捕捉和碱性磷酸酶标记的羊抗鸡轻链抗体的检测。

纯化鸡卵黄免疫球蛋白是作为标准。

2.7.Western blotting杂交鸡软抗体的检测进行如前。

在过氧化物酶标记的抗鸡IgG - Fab片段是用于开发的反应，并加ECL。

南松-荧光信号，然后分析了使用荧-nescent图像分析仪。

西方的朊蛋白检测杂交进行如前所述。

简言之，用%10正常鼠脑组织匀浆分离12.5的SDS-PAGE.膜转让和阮病毒检测人进行的方式一样，对转染或HUC2培养上清-13被用来作为第一抗体和酶标记，？nity纯化阳抗lgG用作第二抗体2.8青霉菌的治疗稳定的（HF33，4 × 105个细胞）转染细胞培养24 h.在细胞用PBS后，洗涤液中加入不同浓度（0,1,3,10毫克/毫升的衣霉素）（1抑制剂的N -糖基重刑）（和光，日本）的补充试剂.分离上清，然后收集，24 h后，用收集西方的鸡免疫印迹检测链。

2.9提纯重组免疫球蛋白稳定转染细胞在F12培养液无血清培养的含10％FBS.同一液体被用来洗细胞，和细胞培养四天血清培养基收集培养上清，并通过膜过滤，以去除死皮细胞.上清，然后与ProBond树脂纯化布相平衡，混合（50毫米的钠，磷，pH值7.5,0.5 M氯化钠）。

树脂被冲走了净化液物，其次是净化液含10毫米咪唑。

重新用组合IGY是洗脱净化，载有200毫米洗脱抗体的一小部分咪唑.为洗脱抗体的纯度在非还原条件下进行了分析部分10%的SDS-PAGE凝胶。

为了探讨的L和H链分开，用B -巯基乙醇处理样品.蛋白质沾满考马斯亮蓝。

3结果3.1制粒的构建总的杂交瘤细胞（HUC2 - 13）RNA的分离和鸡抗体cDNA进行PCR扩增由反转录后获得。

扩增的基因含有的L和H链，分为VL，VH，每断在不同的区域.因为在L和H链可变区基因，从cDNA序列扩增开始，他们并没有包含内含子.后在序列证实，用DNA的L和H链片段到pcDNA3/myc-his和pcDNA4/myc-his插入（指定pcCKL1和pcCKH1，分别）。

在L链基因，myc基因表位和他的标签是在pcDNA3/myc-his没有翻译，因为他们所在的停止密码子.在另一方面下游，为H链基因，myc基因表位基因被删除，因此只有他的标签是翻译。

3.2鸡抗体在CHO细胞中的表达CHO细胞共转与pcCKH1和pcCKL1作为描述材料和方法.未稳定转染与遗传学霉素和Zeocin.克隆抵抗两种药物是由特定的免疫选择以特定生产的稳定转染克隆上清.一具体球蛋白被指定HF33.这特定测试的抗体生产各级ELISA在HF的recombi-楠球蛋白是在大约10至15 mg/106 cells/24 h.这种生产比出现在较高的生产水平的杂交瘤细胞HUC2-13生产不到1mg/106cells/24每小时要高很多3.3抗体纯化重组重组免疫球蛋白使用镍树脂分离纯化得到的超级natants血清的HF33.IgY自由的遗传，主要是由于200毫米咪唑洗脱。

与布洗脱的分数？用含200毫米咪唑分析10％的SDS - PAGE。

在非还原条件下，球蛋白样品，分为两个频段，在约250 kDa和主要带一小乐队约150 kDa的，相应的完整的半分子，分别为，还原的条件下，1 H链和两个L链检测。

这些结果表明重组免疫球蛋白的纯化可以在下一个步骤使用镍树脂。

4.讨论鸡卵黄抗体不激活人类补体系统，也不与类风湿因子，蛋白A，蛋白G或其他任何免疫球蛋白反应，这消除了假阳性结果和人抗鼠抗体反映.除此外，动物的反应，因为avianhost抗原系统发育，从哺乳动物来源的细胞，对高度保守的哺乳动物蛋白的活性禽流感抗体可以产生反应.通过融合细胞系的研究已经开发生产鸡杂交瘤。

抗体杂交瘤细胞生产的鸡一般个体小.此外，纯化鸡卵黄抗体是，因为它不与蛋白A或G反映约束进一步纯化和大鸡卵黄抗体规模化生产，我们试图在CHO 细胞.重组表达鸡卵黄抗体IgY的提纯容易可以在一个加强与镍1？nity树脂，并作为一个主要的单频（250 kDa的在考马斯亮蓝）染色检测凝胶。

此外，重组免疫球蛋白是在大约10-15 mg/106cells/24 ħ生产在稳定的跨fectant，是HF33 HF33.IgY生产水平的10倍以上的杂交瘤细胞HUC2高出13.可以进一步改善甲氨蝶呤的依赖的DHFR基因扩增能力。

关于多样化抗体在鸡nism，在对比的是哺乳动物的基因转化率，而不是单一功能V,J和D 段. 这使得一个放大的每个L和H链的引物抗体的可变区基因. 因此，所有的鸡卵黄抗体基因的扩增，可以使用本文章.此外，VL和VH使用噬菌体克隆可变区区域都通过转化为L和H鸡卵黄抗体链的表达质粒的区域插入描述引物,当重组抗体在使用印迹法，检测灵敏度高于与噬菌体事显示抗体，鸡卵黄抗体可被视为在实验室研究的多用途工具，本研究可以进一步的应用于医疗等领域使用的免疫球蛋白，如诊断技术。