激酶检测：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）
基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC
活化度）。

操作步骤：
1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。

2．在4℃，用14000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。

3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。

用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。

4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到
2.5ug/ml。

随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。

5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。

6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×BufferPepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。

在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。

阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。

标准PKC检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer，5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)，5ul
PKC Activator 5X Solution 超声处理的，5ul
短肽保护液（非必须），1ul
样品， 9ul
去离子水使终体积为，25ul
PKC阳性对照检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer，5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) ，5ul
PKC Activator 5XSolution 超声处理的，5ul
短肽保护液（非必须），1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer），4ul
去离子水使终体积为，25ul
PKC阴性对照检测（不加PKC）
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer，5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) ，5ul
PKC Activator 5XSolution 超声处理的，5ul
短肽保护液（非必须），1ul
去离子水使终体积为，25ul
7．在0 时间点，把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2 分钟。

然后加入样品或蛋白激酶C 在30℃再孵育30 分钟。

8．把管子放进开水浴或95℃加热块10 分钟以终止反应。

在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃或-20℃。

9．把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul 的80％甘油，以确保样品保留在上样孔中（说明书第III.F 部分）。

10．每孔点样10ul，在0.8% 琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。

检测结果：
说明：后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。

注：阳性条带以Gel pro4 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。

按照百分比例计算PKC活性百分比
（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）
Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Lane 6Lane PC
Rows( % )( % )( % )( % )( % )( % )( % ) PKC77.08275.61688.9866.97577.9374.645100 p-PKC22.91824.38411.0233.02522.0725.3550
Sum100100100100100100100 p-
0.297320.3224710.1238480.4930940.2832030.3396740 PKC:PKC
样本#1#2#3#4#5#6PC。