上海生博AAV产品手册（2017版）一、AAV背景知识1.1AAV概况腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，是一类无包膜的细小病毒，属于微小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependoparvovirus)，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)下，AAV病毒本身呈二十面体结构。
AAV 基因组为约4.7kb的线性单链DNA(single strand DNA，ssDNA)，只含两个基因，Rep(Replication)基因和Cap(Capsid)基因。
AAV为目前发现的基因组最简单的复制缺陷型病毒，也因此，AAV被作为病毒载体广泛应用。
FIG1 AAV的3D构象图FIG2 AAV病毒颗粒的组分构成FIG1和FIG2文献出处：Mingozzi, F. and K.A. High.Blood, 2013. 122(1): p. 23-36.FIG3 AAV TEM图Zinn, E., et al.. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68.1.2AAV的ITR区AAV基因组的5’和3 ’端各有一个长度为145bp的倒转重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，是AAV复制和包装所必需的最少的自身序列。
ITR区富含GC(>80%)，可折叠为一个自我互补的T型发卡结构，其中的Rep蛋白结合位点(Rep binding elements，RBE)、RBE’和末端解链位点(terminal resolution site，TRS)是AAV 基因组的复制起始的关键。
另外ITR区还含有包装信号，是AAV整合、复制和包装所必须的顺式作用元件，并具有转录启动子活性。
FIG4 AAV基因组结构图Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.FIG5 AAV ITR区的二级结构图(以AAV2序列为例)Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.1.3AAV的ORFAAV含有两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Rep基因和Cap基因。
左侧的ORF含Rep基因，可编码4个非结构蛋白-Rep40、Rep52、Rep68和Rep78，对AAV的复制、转录、基因组整合和包装必不可少。
Rep使用p5启动子产生非剪切和剪切后的转录产物，后翻译得到分子量较大的Rep78和Rep68蛋白；p19启动子则可产生更短的非剪切和剪切后的转录产物，经翻译得到分子量较小的Rep52和Rep40蛋白。
右侧的ORF含Cap基因，可编码3个结构蛋白-VP1、VP2和VP3，Cap使用p40启动子，经剪切后产生两个转录本，较长的转录本翻译产生分子量为87KD 的VP1蛋白，较短的转录本可使用两个密码子，由非传统的ACG起始密码子起始，得到72KD的VP2蛋白，下游传统的AUG起始密码子起始，得到62KD的VP3蛋白。
5个VP1、5个VP2和50个VP3蛋白共同构成AAV的病毒外壳(VP1:VP2:VP3=1:1:10)，衣壳表面由VP3、VP1的C端和VP2的C端构成，VP1和VP2的N末端位于衣壳内部。
FIG6 AAV 蛋白的编码Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93. 1.4AAV的复制AAV是复制缺陷型病毒，需要腺病毒(Adenovirus，Adv)或疱疹病毒(Herpesvirus)等辅助病毒提供DNA聚合酶和解旋酶，参与复制。
通常情况下，我们将用目的启动子和基因取代AAV的基因组本身的rep和cap基因，得到重组AAV(recombinant AAV，rAAV)的基因组质粒。
在体外AAV包装系统中，除去rAAV质粒，还需要一个含有rep和cap基因的外壳质粒、一个含E2a、E4和VAI RNA基因的辅助质粒(E2a表达一个ssDNA结合蛋白质，以促进AAV DNA复制，E4编码增进mRNA装运到细胞质的蛋白质，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译)，在辅助质粒的帮助下，ITR将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。
rep和cap 基因转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。
FIG7 rAAV的基因组及包装Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800. 1.5AAV的生活史自然情况下，AAV感染细胞后，之后的过程可分为七个阶段，即：(1)AAV与受体的结合，(2)病毒颗粒的内摄，(3)囊泡的运输，(4)内涵体的脱离，(5)核转运，(6)病毒脱壳，(7)在辅助病毒存在，提供DNA聚合酶和解旋酶时，基因组DNA进行复制。
但是当没有辅助病毒的存在时，AAV定向整合至19号染色体(q13.4)，被称为AAVS1，仍可进行复制，但不产生或包装子代感染性病毒颗粒。
而体外包装得到的rAAV感染细胞后，通常不会整合到基因组，而是串联形成附加体(类似细菌的质粒)存在于细胞核中，从而保持长期稳定的基因表达，对于终末分化的细胞，该优点特别明显。
FIG8 rAAV生活史Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.1.6AAV的血清型AAV在动物体内表现为有多种血清型，这是由于AAV有多种不同的外壳蛋白，不同血清型的AAV，感染过程中使用的受体也不尽相同（表格1），因此感染的组织器官和效率也各有差异（FIG9）。
目前，在人体内发现12种AAV，AAV1-AAV12，而在非哺乳类动物体内则发现100多种的AAV血清型。
现有研究所用的AAV中，AAV2、AAV3、AAV5和AAV9是从人体内分离得到的，其他血清型的AAV均为动物体内分离得到（表格1）。
自然情况下，80%的AAV感染都是AAV2感染，而AAV2也是最早被分离并应用最广泛的血清型，但是AAV2感染范围较窄，而人们也在不断研发新的AAV血清型，AAAV2已被其他血清型逐步替代。
表格1 AAV血清型及其受体Miyake, K., et al. J Nippon Med Sch, 2012. 79(6): p. 394-402.FIG9 AAV1-9感染小鼠效果图Zincarelli, C., et al. Mol Ther, 2008. 16(6): p. 1073-80.AAV血清型：AAV1-9小鼠模型：雄性Balb/C小鼠(8-10周龄)接种剂量：每只小鼠1×1011vg(in 312ul PBS)接种方式：尾静脉检测时间：接种后29天-9个月检测操作：活体成像目前大家广泛认同的不同组织推荐使用的AAV血清型如下表所示：表格2 AAV1-9组织亲和性表格1.7rAAV的体外包装通常情况下，野生型AAV指的是AAV2，现有的rAAV质粒，其ITR区也多来自于AAV2，在包装rAAV时，我们通常选择使用带有目的血清型cap基因的外壳质粒，从而得到目的血清型的rAAV，我们一般书写为rAAV2/1-9。
FIG10 体外rAAV包装系统Beltran, W.A. Vet Ophthalmol, 2009. 12(3): p. 192-204.1.8rAAV特点及优点AAV具有广泛宿主范围、高滴度病毒生产能力和长期基因转染潜力等的特征，因此被人们认为是基因传递和表达的一个重要工具。
AAV与其他常用的工具病毒(如慢病毒和腺病毒)的区别如下图所示：FIG11 AAV与腺病毒慢病毒的区别rAAV作为工具载体，具有以下优点：FIG12 AAV作为载体的优点二、AAV在神经系统研究中的应用2.1rAAV应用与神经系统概况rAAV(如AAV9和AAV-PHP.B)可以穿透血脑屏障，因此，与腺病毒及慢病毒等工具病毒相比，AAV更适于中枢神经系统方面的研究，是最理想的神经元和胶质细胞感染工具。
对神经系统的各项研究中，功能研究对于精神疾病的发病机制、预防、诊断和治疗都至关重要，是现阶段神经科学领域的热点，而AAV可高效地应用于中枢神经系统功能研究的各个方向。
FIG13 中枢神经系统研究2.2生博rAAV载体可选元件现阶段，我们可应用于rAAV载体的启动子如下所示：2.3光遗传系统2.3.1光遗传系统概况光遗传学(optogenetics)技术，一种新型的用于研究神经的技术，简单理解即为光学(optics)与遗传学(genetics)的结合，是将光敏感的分子或离子通道转移到神经细胞里面，然后用光照射，使神经细胞被激活或抑制。
光遗传学应用范围广泛，神经生物学方面，可用于解释某种生物现象或对哺乳动物行为进行调控；分子生物学方面，可靶向不同种类细胞的生命活动和功能；医学方面，可改善或治愈某些因神经系统功能障碍引起的疾病，如阿兹海默症(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)和精神分裂症(Schizophrenia)等。
FIG14 光遗传学流程图Cho, W.H., E. Barcelon, and S.J. Lee. Exp Neurobiol, 2016. 25(5): p. 197-204.FIG15 光与神经网络图FIG16 光遗传学应用图Boyden, E.S. Cerebrum, 2011. 2011: p. 16.Park, S.I., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(50): p. E8169-e8177.光遗传相关通道蛋白分类神经蛋白名称原理作用效果光遗传激活hChR2(H134R) Na+通道神经元激活2.3.2rAAV在光遗传系统中的实际应用光遗传应用举例1FIG17 分别携带光遗传相关通道蛋白ChR2和eNpHR3.0的AAV5-eYFP定位注射至初级躯体感觉皮层，3周后，检测光遗传相关通道蛋白ChR2和eNpHR3.0的表达Brill, J., et al. 2016. 3(4). doi: 10.1523/ENEURO.0142-15.2016.AAV血清型：AAV5小鼠模型：Parv::Cre转基因小鼠(第40代，25-30日龄)接种剂量：每只鼠接种1×1012vg(in 1ul PBS)接种部位：两侧的初级躯体感觉皮层检测时间：接种后3周检测方式：取脑组织，固定，免疫组化检测光遗传应用举例2FIG18 在VTA部位定位注射AAV-Arch-GFP，AAV可携带Arch至神经元，使用光遗传技术，抑制含PV和SOM的神经元的功能Zhu, Y., et al. Nat Commun, 2015. 6: p. 6802.AAV血清型：AAV(文献里没有说明)小鼠模型：雄性Cre转基因小鼠(3周龄)接种剂量：每只鼠接种1×109vg(in 0.5ul PBS，0.05ul/min)接种部位：腹侧被盖区(VTA)检测时间：接种后10-14天检测方式：取脑组织，固定，免疫组化检测2.4Ca2+通道2.4.1Ca2+通道概况Ca2+与神经元细胞密切相关，当神经元活动的时候，胞内Ca2+浓度能上升10-100倍，增加的Ca2+对于含有神经递质的突触囊泡的胞吐释放过程必不可少。