开题报告
药学
菲律宾蛤仔酶解多肽的分离及体外抗氧化作用研究
一、说明选题的依据和意义
菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum），隶属于软体动物门（Mollusca）、双壳纲（Bivalvia）、帘蛤科（Veneridae）的海洋生物，俗称花蛤，是我国四大养殖贝类之一。

花蛤肉组织蛋白含量高，脂肪含量低，并含有丰富的维生素和微量元素，具有良好的营养保健功能。

中医认为，蛤肉有滋阴明目、软坚化痰之功效。

近代研究表明，菲律宾蛤仔提取物具有提高免疫力、抑制细胞微核形成、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗菌等作用。

传统医学与现代研究均证实了菲律宾蛤仔的医疗保健作用，但是至今还没有将其开发成产品投入市场。

海洋是全球生命支持系统的一个重要组成部分，也是一种有助于实现社会、经济可持续发展的宝贵财富。

向海洋进军, 开发利用海洋资源, 成为扩大人类生存空间、增加资源储备的重要出路。

海洋生物技术作为一个全新的学科，已经成为21世纪海洋研究开发的重要领域。

当前世界各国对开发海洋药物和功能特殊的海洋生活活性物质都给予了高度关注。

浙江省海洋生物资源丰富，发展海洋经济具有得天独厚的条件，本项目研究为促进浙江省的十一五规划建设、加快实现海洋经济大省的步伐、成为“海上浙江”，打破资源限制具有重要意义；为促进功能性产品开发和海洋药物产业化的发展也具有重要的意义。

此外，菲律宾蛤仔是我国重要的养殖贝类，将其进行药物保健品的研究开发，不但不会破坏生态平衡，还将会为它的高值化利用寻找新的出路。

超氧化物阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、过氧化自由基（ROO）和羟自由基（-OH）等自由基是生物体在新陈代谢过程中产生的中间产物，具有很强的氧化作用。

正常生理情况下，机体内的抗氧化酶及非酶类因子可以将自由基有效地清除，从而维持自由基产生与消除的平衡状态，但自由基多数不稳定，在病理情况下，可以迅速引起脂质的过氧化。

自由基通过造成细胞膜、DNA和蛋白活性的损伤，并与动脉硬化、脑卒中、阿尔茨海默病、肥胖、白内障以及肝脏疾病等多种人类疾病相关。

人体细胞膜上存在多种脂质，尤其脑细胞膜含有许多易被氧化的多不饱和脂肪酸，脂质的过氧化通过破坏细胞膜而造成细胞损伤，导致人体疾病的发生。

因此，对体内自由基的清除是防御机体疾病发生的一个重要途径。

由于合成的抗氧化剂多数存在安全隐患，因此，目前关于天然抗氧化剂的开发和应用成为了研究热点。

已有研究表明，来源于多种蛋白的活性肽都具有抗氧化活性，这些多肽
多数是由不同酶对蛋白的水解产生的，酶解方法是从蛋白中获得生物活性肽的有效方法之一，作为一种提高蛋白质活性功能和营养价值的方法已被方泛应用。

饮食当中的蛋白质在肠道中主要以多肽和氨基酸的形式被吸收，多肽在机体抗氧化过程中起着重要的作用。

生物活性肽（biologically active peptides）是指那些具有特殊生理活性的肽类，是世界上药物及保健品研究的热点，目前通过蛋白酶解生产的活性肽主要来源于陆地的蛋白源，如牛乳酯蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等。

海洋生物为了适应高盐、高压、低温、缺氧等极端的海洋生境，其蛋白质的氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。

近年来对海洋生物活性肽，特别是抗氧化活性肽的研究取得了很大进展。

人们现如今已从海鞘、海绵、软体动物、珊瑚中提取环行多肽，从贝类、海参、乌贼墨等中提取的糖蛋白，还有从海藻、鲎、鲨鱼软骨中提取的多肽。

但是由于海洋资源的开发利用较晚，海洋活性肽尚未形成规模产业，因此，借鉴陆地活性肽开发的酶工程技术，以海洋生物蛋白资源为原料，通过对酶解、制备等工艺的综合研究，即可研制出陆地蛋白源和化学合成所无法生产的系列天然、高效、新颖的生物活性肽。

综上所述，应用酶解海洋生物蛋白制备氧化多肽可为人类提供结构新颖、功能独特和生理活性很强的抗氧化多肽，但对菲律宾蛤仔的相关研究目前尚未见报导，因此本实验通过现代分离技术和实验提取抗氧化活性物质，挖掘其潜在的药用价值，开发抗氧化的天然保健品提高海水养殖贝类的高附加值，带动相关产业链的形成并对其他海洋软体动物的开发具有重要的经济利益和社会利益。

二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：
（一）基本内容：
1、酶解：首先选用几种不同的蛋白酶，在其最优酶解条件下对菲律宾蛤仔进行酶解，分别测定各酶解物的抗氧化性能，找出具有最强抗氧化活性的蛋白酶酶解物，从而确定最佳的蛋白酶。

2、分离纯化：通过超滤、离子交换层析、分子筛层析和高效液相等分离纯化技术，最终纯化出具有高效抗氧化性能的活性多肽，并测定其一级结构。

3、抗氧化活性的测定：通过对DPPH自由基、O2-自由基、羟自由基、H2O2以及还原力等多种途径来考查纯化后获得的多肽的抗氧化性能，从而为其以后开发成为保健产品奠定基础。

（二）拟解决的主要问题：
最佳酶解温度与蛋白酶浓度的确定，通过多次实验与校正得到解决。

三、研究步骤、方法及措施：
1. 查阅文献资料；掌握实验中所用到的各种仪器和设备的操作要领及注意事项；熟记各种试剂的注意事项。

2. 准备实验相关的器材和试剂。

3. 选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶等4种蛋白酶分别对菲律宾蛤仔进行酶解，通过对Fenton反应体系产生的羟自由基的清除作用来考查各酶解物的抗氧化活性；经截取分子量为3KDa和5KDa的超滤膜、DEAE SepharoseFF阴离子交换、反相高效液相色谱C18分离制备菲律宾蛤仔酶解多肽，并测定其清除羟自由基活性。

4. 实验结果的处理和论文的撰写。

四、参考文献
[1] Keisuke GT,Takuo K, Kiyokun M. Purification and antibacterial characterization of a novel isoform of the Manila clam lectin (MCL-4) from the plasma of the Manila clam, Ruditapes philippinarum[J].Comp Biochem Physiol,2008,150:45–52.
[2] 魏玉西,郭道森,李荣贵,等. 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinesis) 血浆中防卫素的纯化及其抑菌功能[J].生物化学与生物物理学报,2003,35(12):1145-1148.
[3] 张莉,刘万顺,韩宝芹,等. 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)蛋白聚糖的分离提取及其抗肿瘤活性的初步研究[J].海洋与湖沼,2007,38(1):62-68.
[4] 邢成名,尚延昌,袁晓玲,等. 菲律宾蛤仔对兔动脉粥样硬化的预防和治疗作用研究[J].青岛大学医学院学报,2005,41(2):137-143.
[5] 常林瑞,黄清荣,孙振兴,等. 菲律宾蛤仔多糖提取物抑制蚕豆根尖细胞微核形成的研究[J].食品科学,2009,30(3):235-138.
[6] 范秀萍,吴红棉,王娅楠,等. 菲律宾蛤仔糖胺聚糖的免疫活性研究[J].食品科学,2008,29(4):370-372.
五、研究工作进度：
（1）2010年10月-2010年11月收集、整理文献资料，完成开题报告的撰写。

（2）2010年12月-2011年01月撰写综述并翻译一篇与本论文有关的英文文献
（3）2011年02月-2011年03月酶解菲律宾哈仔确定最佳的酶解条件，得到最佳的酶解产物及抗氧化活性的测定
（4）2011年04月-05月进行实验结果分析，完成论文撰写。