基因突变分析技术综述湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室 (长沙 410087)阮庆国 陆春叶综述 夏家辉审校提要 基因突变分析是确定某一未知基因与某遗传病之间关系的关键步骤,也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段,本文对19种基因突变分析技术进行了分类综述,特别对近几年发展起来的几种新技术进行了详细介绍,并讨论了毛细管电泳在基因突变检测中的应用。
于1990年10月正式启动的人类基因组计划到今年已正式实施了八年,该计划的目标可概括为两点,即: 人类3×109bp的全序列分析; 全部基因的识别及功能分析。
据估算人类基因组中约包括5～10万个基因,它们分布在24个不同染色体和线粒体上,到1998年1月为止,已克隆的人类功能基因达到5052个,但确定与某一特定遗传病相关的基因只有821个,目前已被认定的孟德尔遗传病有1402种,这些病都至少与一个或几个基因的突变相关。
研究人类的全部基因,特别是与疾病相关的基因的结构、功能以及各种基因突变与疾病的关系,是人类认识遗传病的发病机理,并最终达到对遗传病进行基因诊断和基因治疗的重要环节。
从20世纪80年代开始,一系列寻找新基因的方法得以应用,如消减杂交,mRNA差异显示,外显子捕获等,基因克隆的策略也从最初的功能克隆法,候选基因法发展到今天的定位克隆法以及定位候选克隆法,并且染色体上已定位和测序的cDN A越来越多,表达图谱的内容越来越丰富,这就给发现新的未知基因,了解各基因的功能及其突变导致的疾病创造了极为有利的条件,从而大大加快了人类遗传病致病基因克隆的步伐。
但是在找到了一系列的候选基因之后,要确定哪一个基因是该病的致病基因,还需在相应的病人中进行突变检测。
在过去的十几年中,虽然已有19种突变分析的技术得到发展,但总的来说,寻找一种快速、高效而又经济的方法仍然是很多科研工作者的研究目标。
本文对突变分析的种种方法进行了分类综述,特别对近期出现的几种新技术进行了详细的讨论。
突变分析技术按其研究对象主要分为两大类,即: 对未知突变进行分析,即确定某一未知基因与某遗传病的关系; 对已知突变进行分析,即在临床上对致病基因已克隆的遗传病进行基因诊断。
在实际应用中许多检测未知突变的方法也可用来对已知突变进行检测。
一、对未知突变进行分析的方法1.RNA酶A切割(Rnase A cleavage)在一定条件下,异源双链核酸分子RNA: RN A或RNA:DN A中的错配碱基可被RNase A切割,切割产物可通过跑变性胶得到分离。
RN A探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到,当RNA 探针上错配的碱基为嘌呤时,RNase A在错配处的切割效率很低甚至不切割,而当错配碱基为嘧啶时,则其切割效率较高。
所以如果仅分析被检DNA的一条链,其突变检出率只有30%,而如果同时分析被检DNA的正义链和反义链,则有效率可达到70%[1]。
尽管RNase A切割法有其局限性,如需使用同位素,需将PCR 产物克隆至表达载体上,从而增加了操作的复杂度,但由于它能对1～2kb的片段进行检测,并能确定突变位置,且无需使用有害化学试剂,故仍被频繁使用。
2.变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradi-ent Gel Electro phoreris,DGGE)该方法的原理是:双链DNA分子在一定变性剂浓度的凝胶上电泳时,会在一定的时间・225・发生部分解链,导致电泳迁移率下降,当正常的DNA分子和发生突主的DNA分子之间即使只有一个碱基对的差异时,也会在不同时间发生部分解链,从而被分离成两条带。
为了提高检出率,还可将突变的DNA和正常人的DNA混合变性再变性,然后再在上述条件下电泳,则会形成四条带,即突变的DNA分子,正常的DNA 分子和两种发生错配的DNA分子,检测某种突变所需的特定的变性剂浓度可通过变性梯度凝胶电泳来确定[2]。
在两个同源双链DNA分子间有一个碱基对不同时,其T m值就相差1℃或更高,有一个碱基错配的异源双链DNA分子与同源双链DNA分子比较,其T m值可相差6℃以上,由于其T m值不同,这些有一个碱基错配或一个碱基对不同的双链DNA分子中发生突变的区域就会在不同的时间发生解链,从而被分离。
利用DGGE技术检测突变时应考虑的一个问题是当突变发生在高熔点区时则难以检测到突变,原因有二个: 随着熔解区域(T m值不同)的增加,迁移率的变化减少,难以将正常DNA分子和突变DNA分子分开,而当整个DNA分子完全解链时,其迁移率只取决于单链的长短; 突变区域发生解链需要较长时间,故检测所需的时间较长。
为了检测到所有可能的突变,在进行DGGE之前将所需检测片段的序列输入计算机,利用相应软件(如Bio-Rad公司的M acM elt So ftw are)进行分析,如发现突变位于高熔点区,则最好在一个PCR引物的5′末端加上一段约40～50bp的GC夹[3],但如果突变发生在GC富集区(如CpG岛),仍难以检测到,同时,该方法对肿瘤的突变检测有困难,尤其是对实体瘤,且该法不能确定突变位置。
该方法的优点是如果突变发生在最先解链的DNA区域,则其检出率可达到100%,其检测的片段可达1kb,尤其适于100～500bp的片段。
3.杂合双链分析法(H eteroduplex analy-sis,HA)由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA 不同的迁移率,从而使两者被分离开。
该方法原理与单链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链,而HA法分离的是双链。
HA 法简单迅速,但只适用于200～300pb的片段,且不能确定突变位置,检出率只有80%左右,有人建议将H A法和SSCP法联合使用,可能将检出率提高到接近100%[4],也有科研工作者建议使用缺失的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度[5]。
4.化学切割错配(chemical cleavage of mismatch,CCM)化学切割错配是在Max am-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA ∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydrox ylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osm ium tetro xide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变[6]。
只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞[7]。
该方法的最大优点是能对长至2kb的片段进行分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。
5.碳化二亚胺检测(Carbodiim ide,CDI)与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰,当用标记的引物对CDI修饰过的双链DNA进行DNA合成时,延伸会在修饰过的碱基处终止下来,合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测出是否有突变。
该方法的最大优点也是能对1～2kb的片段进行分析,突变检出率达到100%,能确定突变位置,并且CDI是一种没有毒性的物质[6],有报道曾用该法检测出了7.2kb DNA片段中的一个点突变[7],但当一个DNA片段中存在多个突变时,该方法就不适用。
6.酶促切割错配(Enzym e M ismatch Cleav age,EMC)・226・ EM C是一种与RNase A切割相类似的方法,T4核酸内切酶Ⅶ是一种分解酶(reso lvase),能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附近进行切割,酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变[9],电泳产物的检测可用放射自显影,也可用银染。
由于该法能对DNA∶DNA异源杂合分子进行分析,因而省去了体外转录的步骤,其最长检测片段可达到1.5kb,该法的缺点是存在非特异性切割现象,并且对有些错配碱基的识别不是100%,因此在每次检测时都必须设有一个内对照。
7.单链构象多态性(Single-Str and Con-fo rmational Polymor phism,SSCP)该方法的原理是[10]:单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使是一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。
由于SSCP法简单快速,因而被广泛应用于未知基因的突变分析和临床检测。
该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变,由各实验室报导的突变检出率从99%到35%不等。
由于随DNA片段大小的增加,迁移率的改变明显减小,故而该方法只适合用来检测150～200bp的DNA片段[11]。
一般来说对小于200bp的片段其检出率可达90%,而对大至400bp的片段,其检出率可能只有70%～80%。
同时该方法要求多次摸索条件,如电泳温度,胶中甘油浓度以及胶联度等均可影响检测的灵敏度。
至于突变类型,除G到T的置换外,似乎对其检测的灵敏度并无大的影响,此外,该方法不能确定突变的精确位置。
尽管如此,由于SSCP 的使用简单便利,科研工作者在应用中对其进行了不断地改进,这些改进包括:优化电泳条件,多重PCR的使用,对较大片段的PCR产物先进行酶切消化再跑电泳,毛细管电泳取代普通胶电泳以及自动测序仪的使用等。
尽管这些改进增加了该方法的复杂度和花费,但却使SSCP的检出率大大提高,接近于100%。
此外,使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度,尤其是对大于200pb的片段[12]。
8.切割片段长度多态性(Cleavage Frag-ment Length Polym orphism CFLP)CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性(RELP)和SSCP基础上发展起来的一种基因突变检测技术,其原理是:双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构(包含多个折叠的发夹状结构),正如SSCP一样,这种二级结构取决于DNA的核苷酸组成和顺序,即使有一个碱基的差异,也会形成不同数目的折叠状发夹结构,而Cleavase I外切酶能识别这种发夹结构,并在该结构的附近进行切割,切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出现与正常对照不同的酶切图谱[13]。
目前已有厂家生产了专门的试剂盒来进行这方面的工作,如Boehringer M annheim(BM)公司提供的CFLP Scan kit。
从理论上来说,该方法比较简单,能同时处理大量的样品,灵敏度也比SSCP高,但M addox LO等通过检测Iduronate 2-sulfatase(IDS)基因第八外显子中已知的六种突变,发现SSCP技术能检测到全部的六种突变,而CFLP技术仅能检测到六种突变中的三种[14]。