第五章临床生化检验方法的选择和评价临床生化检验方法的选择和评价，是临床生化检验质量控制的重要基础工作。
当建立一个新的方法，或引进新的方法、都应对它们的技术性能作出评价，以便科学的选择和应用。
它们之间的关系可用图5-1 来表示。
图5-1 方法选择和评价与其它实验之间的关系图5-1 方法选择和评价与其它实验之间的关系第一节检验方法的正确选择一检验方法和标准品的分级（一）方法的分级临床生化检验方法根据其准确度与精密度的不同可以分为决定性方法、参考方法、常规方法等三级。
1．决定性方法（definitive method）是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。
用于发展及评价参考方法和一级标准品。
2．参考方法（reference method）是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。
这类方法在条件许可的实验室中应经常使用。
用于评价常规方法和试剂盒，鉴定二级标准品。
3．常规方法（routine m ethod）指性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。
这类方法经有关学术组织认可后可称为推荐方法（recommended method），推荐方法应具有足够的实验证据。
临床化学决定性方法及参考方法见表5-1。
表5-1 临床化学决定性方法及参考方法（Tietz，clin chem. 1979, 25: 834）项目决定性方法参考方法钙ID-MS 原子吸收分光光度法氯电量滴定法、中子活化法电流滴定法镁ID-MS 原子吸收分光光度法磷ID-MS ——钾ID-MS、中子活化法火焰光度法钠重量分析法、中子活化法火焰光度法白蛋白——免疫化学法总蛋白——双缩脲法肌酐ID-MS、离子交换层析法离子交换层析法尿素ID-MS 尿素酶法尿酸ID-MS 尿酸酶法（紫外法）胆红素——重氮反应法葡萄糖ID-MS 己糖激酶法胆固醇ID-MS Abell-Kendall 法，胆固醇氧化酶法甘油三酯ID-MS 酶法AST（GOT）——MDH-NADH 法ALT（GPT）——LDH-NADH 法转肽酶（r-GT）——连续监测产物生成法肌酸激酶——NAD+偶联法注：ID-MS：同位素稀释一质谱法MDH：苹果酸脱氢酶LDH：乳酸脱氢酶（二）标准品的分级国际标准化委员会将标准品（参考物）的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定；被用于校正仪器或用于评价一种测定方法的物质，并将其分成三级。
1．一级标准品（原级参考物）是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量，且有证书；用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为二级标准品定值。
2．二级标准品（次级参考物）也称校准品，包括用于常规分析的标准液。
这类标准品可由实验室自已配制或为商品，它的示值必须用一级标准品和参考方法并由训练有素的，能熟练掌握参考方法的操作者确定；主要用于常规方法的评价或为控制物定值和常规测定的结果计算。
3．校准品用二级标准品和常规方法测定得到校准品，用于常规测定中的标准。
各级测定方法及标准品之间的相互关系及准确度传递见图5-2。
图5-2 方法与标准品之间的准确度传递二常规方法的选择（一）常规方法的性能指标国际临床化学协会（IFCC）提出：常规方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标，至于某一项具体分析方法所应具有的性能标准，可由临床化学家根据采用这一试验的目的决定。
（1）实用性：一般应具备微量快速，便于急诊；费用低廉；应用安全。
（2）可靠性：一般具有较高的精密度和准确度，以及较大的检测范围。
精密度即变异系数（CV%）一般应小于5%。
准确度是指测定值与“真值”的符合程度，一般偏差系数（CB）应小于5%。
特异性是指只对待测物质起化学反应，不与其他结构类似的化合物发生反应。
检测能力即“检测限度”或“检出限”。
检出限通常是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小量。
（二）常规方法的选择程序首先根据方法选择的要求对已发表的各种检测方法进行比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据及真实的使用价值。
经初步选定的方法称为候选方法。
候选方法确定后，要熟悉该法的原理、性能指标及相应的条件等。
然后进行初步试验，为了实用的目的，初试应该评价候选方法所有的性能指标。
第二节临床生化检验方法学评价方法学评价（evaluation of methodology）的基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密度与不准确度，无论是精密度还是准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。
一、方法评价方案美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）制订了一套评价方案（evaluation Protocols）,能客观而正确地对方法的技术性能作出评价。
它不仅可用来评价临床生化检验方法，而且还可用以评价试剂盒和分析仪器的性能。
（一）精密度评价1．目的要求评价方法给出结果的可重复程度即精密度。
反映精密度好坏的指标是变异系数CV，CV 越小精密度越好，反之则差，故有人称其为不精密度。
用本方案评价可以计算出批内、批间、日间和总CV，其中总CV 最重要，它代表整个分析体系的可重复程度。
2．评价前的准备①对于评价对象和评价方案均应熟悉。
②实验用试剂应是同批次配制，或同一批号的商品试剂盒和参考物，仪器也应处于良好的工作状态。
③实验用标本一般选择2 个（亦可更多），一个在正常范围或在医学决定水平附近，另一个为异常值，被测物在疾病时增高者用高值，降低者用低值；实验标本的介质应与临床标本一致，并应妥善保存，应保证在整个实验过程中稳定。
④先作一个初步的批内精密度测定，即一个标本重复测定20 次，计算出均值，标准差和变异系数。
3．评价步骤用2 个标本每天测定2 次（2 次测定间隔不得少于2 小时），每次测定均作双份，共测定20 天。
每次测定至少做一个质控。
（二）准确度评价1．方法比较试验目的是评价方法所给出的结果是否准确，采用的是方法比较试验。
在实验的范围内两方法间的平均差异，并确定偏差。
(1)要求方法比较试验理论上是两种方法间的差异均作为试验方法的偏差。
因此比较方法应是参考方法或推荐方法，如该测定没有参考方法或推荐方法亦可用公认的常规方法。
但须具备：①比较试验方法有更好的精密度。
②干扰影响已知。
③与试验方法使用相同的计算单位。
(2)比较前准备①实验者应熟悉所用的仪器、试验方法、比较方法和评价方案。
②实验标本应收集新鲜的正常和异常的临床标本，应有足够宽的浓度范围，各浓度应有合适的比例。
如不能及时测定，标本应妥善保存并应在分析物的稳定期内测定。
(3)方法比较步骤①样本数至少为40 个标本，每个标本用2 种方法分别作双份测定，因此样本应有足够的量，如临床标本的量太少可将2 份含量相近的标本混合。
②每天测定8 个标本，双份测定时第一次按顺序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共测试5 天。
方法比较中实验质料的分配建议见表5-2。
2．回收试验所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。
目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。
（1）方法：将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品，原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品，然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。
（2）回收率计算：理想的回收率为100%，如某法测血钙的回收率为95.7%，有4.3%的比例误差，表明一个含钙真值为2.5mmol/l 的标本,若用该方法测定,约为2.39mmol/l(2.5×95.79% )，误差为0.11mmol/L(2.5Χ4.3%)。
（3）注意事项：①准确吸量,因为被分析物的理论值是根据加入标准液体积及原样品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会影响结果；②样品中加入标准液后,总的浓度必须在方法的分析范围内，一般须加入高、中、低不同浓度做回收试验，计算平均回收率；③加入标准液后，最好使实验样品的被测浓度达到医学决定浓度；④加入标准液的体积一般在10%以内。
若稀释过大，误差将发生改变，甚至消失。
（三）线性评价1．目的要求线性范围是分析方法的一个重要技术指标，它能判断对某一分析方法测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。
常规方法应具有较宽的分析范围，一般应覆盖临床可能出现的高值。
2．评价前准备①熟悉仪器、评价方案和试剂。
②评价标本的介质应与实际测定的标本相一致，理想的标本是病人的低值或高值标本，这往往不易收集到，亦可用病人的混合标本加入分析物作为高值标本，用正常人标本作为低值标本（必要时可作处理如分析物为酶可以加热，小分子化合物可以透析，脂类可用超离心或多价阴离子沉淀）。
③浓度范围应以分析项目的线性要求为准。
线性评价应有5个不同浓度，可选择低值和高值标本各一个，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3 ：1混匀为2号，等份混匀为3号，1：3混匀为4号，2-4号标本的浓度按下式计算：标本浓度= （C1V1 + C5V5）/（V1 + V5）C = 浓度，V = 体积。
（四）干扰试验1．目的要求判断评价方法给出的结果是否受非分析物影响及影响程度。
①干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时，受另一非分析物影响而导致测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。
②干扰物质可分为内源性（标本中存在的）和外源性（外界污染的）两类。
内源性的干扰物有：血清中固有的代谢产物，如甘油三酯测定时血清中的甘油，肌酐酶法测定时血清中的肌酸等；病理情况下生成的：如胆红素，脂类，蛋白质，血红蛋白等；治疗药物，肠道营养等。
外源性表5-2 方法比较中实验资料分配的建议项目 A 组 B 组 C 组 D 组 E 组Glu(mg/dl) <50(10%) 51~110(40%) 111-150(30%) 151-251(10%) 251-SL(10%)BUN(mg/dl) <15(10%) 12~25(40%) 26-50(20%) 51-100(20%) 101-SL(10%)Cr(mg/dl) <1.0(20%) 1.1~2.5(30%) 2.6-5.0(20%) 5.1-10(20%) 10-SL(10%)Na(mmol/L) 120~130(20%) 131~140(40%) 141-150(30%) 151-160(10%)K(mmol/L) <3.0(20%) 3~4.5(40%) 4.5-6.0(30%) >6(10%)Cl(mmol/L) 80~95(30%) 96~105(40%) 106-120(30%)CO2(mmol/L) <15(10%) 15~20(30%) 21-30(40%) 31-40(10%) 41-SL(10%)Ca(mg/dl) <8(10%) 8.1~9(20%) 9.1-11(40%) 11.1-13(10%) 13.1-SL(10%)Fe(μg/dl) <50(20%) 51~150(50%) 151-300(20%) 301-SL(10%)iP(mg/dl) <2.5(10%) 2.6~4.5(60%) 4.6-6.5(20%) >6.5(10%)UA(mg/dl) <3.0(20%) 3.1~5(20%) 5.1-8(20%) 8.1-10(20%) 10.1-SL(20%)TP(g/L) <50(10%) 51~70(40%) 71-90(40%) >90(10%)Alb(g/L) <30(10%) 31~40(40%) 41-50(40%) >50(10%)T-Bil(mg/dl) 0~1.0(30%) 1.1~2(30%) 2.1-5(20%) >5(10%)Cho(mg/dl) <150(10%) 151~250(40%) 251-350(30%) >350(20%)TG(mg/dl) <75(10%) 76~125(30%) 126-200(30%) 201-300(10%) 301-SL(10%)ALP(U/L) <NL/2(30%) NL/2-NL(20%) NL-2NL(20%) 2NL-4NL(20%) 4NL-SL(10%)r-GT(U/L) 0-NL(40%) NL-2NL(30%) 2NL-4NL(10%) 4NL-SL(10%)ALT(U/L) <NL/2(20%) NL/2-NL(20%) NL-2NL(30%) 2NL-4NL(20%) 4NL-SL(10%)AST(U/L) <NL/2(20%) NL/2-NL(20%) NL-2NL(30%) 2NL-4NL(20%) 4NL-SL(10%)LD(U/L) <NL/2(15%) NL/2-NL(20%) NL-2NL(30%) 2NL-5NL(20%) 5NL-SL(10%)CK(U/L) <NL/2(10%) NL/2-NL(25%) NL-2NL(30%) 2NL-5NL(20%) 5NL-SL(10%)Amy(U/L) 0-NL(40%) NL-2NL(30%) 2NL-4NL(20%) 4NL-SL(10%)Hb(g/dl) <9.0(15%) 9.1~12(25%) 12.1-17(50%) 17.1-SL(10%)RBC(×106) <3.0(10%) 3.1~4(30%) 4.1-6(50%) 6.1-SL(10%)WBC(×103) <2.0(10%) 2.1~5(20%) 5.1-11(40%) 11.1-25(20%) 25.1-SL(10%)Platlets(×103) <50(10%) 51~150(20%) 151-300(30%) 301-450(30%) 451-SL(10%)干扰有：标本收集中的添加物如抗凝剂，防腐剂，稳定剂，容器和塞子的污染等；试剂中的杂质和杂酶等。