牛奶中部分成分的分析
一、实验目的
（1）学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白
（2）掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法
（3）熟悉可见光分光光度计的操作
（4）加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼
（5）分析牛奶中蛋白质与钙的含量。

（6）掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法
（7）通过与牛奶包装上注明的含量比较，对实验分析结果进行客观评价
二、实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，加入醋酸将牛乳的pH调至4.7时，使酪蛋白沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质，抽滤、纯化后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。

在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。

操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。

除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。

缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。

补钙越来越被人们所重视。

牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。

对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。

考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指
示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

三、材料、试剂与仪器
（一）材料
新鲜牛奶、加钙牛奶
（二）试剂
95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuS04·5H2O、酒石酸钾、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、铬蓝黑R、盐酸羟胺、邻二氮菲（邻菲啰啉）、浓硝酸、硫代硫酸钠、甲基红、氨水
1.、0.2 mol·L-1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液
先配A液与B液。

A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。

B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸钠固体1.64g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸1.37mL加水稀释至120ml，取A液94.79mL，B液105.21mL, 混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。

2、乙醇—乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）
3、NaOH（6mol·L-1）：称取12g氢氧化钠溶于50mL水中。

4、双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0g，酒石酸钾9.0 g和碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，
加6 mol·L-1NaOH l00mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

5、0.9％NaCl
6、蛋白质标准液(10mg·mL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水
溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。

7、待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的
酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。

（如若不能溶解，滴加几滴6mol/L NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）
8、EDTA(0.01mol·L-1)：称取2.0g EDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至500mL，储存于
聚乙烯塑料瓶中。

9、CaCO 3标准溶液(0.01 mol· L -1)：准确称取基准物质CaCO 30.1g 左右，先以少量水润湿，
再逐滴小心加入6 mol·L -1HCl ，至CaCO 3完全溶解，定量转入100mL 容量瓶中，以水稀释至刻度，并计算其浓度。

10、NaOH （5 mol·L -1） 11、HCl （6 mol·L -1） 12、三乙醇胺(200g·L -1) 13、铬蓝黑R(5 g·L -1)乙醇溶液 （三）仪器
试管、移液管（1mL 、5mL 、20 mL ）、、 l0mL 容量瓶、烧杯、表面皿、250mL 锥形瓶、1000mL 棕色试剂瓶、25mL 具塞比色管、试管架、坩埚、60mL 分液漏斗
水浴箱、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、精密pH 试纸（可测pH4.7），酸度计、电炉、温度计 四、操作步骤
（一）牛奶中酪蛋白的提取 1、酪蛋白的粗提
50mL 鲜牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液50mL 用精密pH 试纸或酸度计调pH 至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心15分钟（3000 r ·min -1）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2、酪蛋白的纯化
用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min -1），弃去上清液。

在沉淀中加入30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3、准确称重，计算含量和得率
含量：酪蛋白g/(100 mL)牛乳
%100⨯=
真实含量
提取得到的含量
得率
（二）酪蛋白含量的测定
1、标准曲线的绘制与样品的测定
取试管8支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。

540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。

2、计算
在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。

由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

（三）钙含量的测定
1、EDTA溶液浓度的标定
准确移取20.00mL CaCO3标准溶液3份分别于250mL锥形瓶中，加入2mL NaOH溶液，铬蓝黑R指示剂3~4滴，用EDTA溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用去EDTA毫升数和CaCO3标准溶液的浓度，计算EDTA溶液的浓度。

2、钙制剂钙含量的测定
准确移取一定量的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH 4mL，加入水
20mL，摇匀，加铬蓝黑R3~4滴，用0.01mol·L-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑R，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。

3、注意事项
量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 mol·L-1EDTA体积为20~30 mL。

牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

思考题
1、了解蛋白质及钙、铁、锌等微量元素与人体健康的关系
3、本实验中哪些物质质量需要准确称量，哪些溶液体积需要准确量取？
4、除本实验选用的方法外，测定蛋白质与钙还有那些方法？。