生物技术综合实验甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达学生：学号：同实验者：<研究背景>谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。

γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。

GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。

实验一甘薯叶片RNA提取一、实验目的1. 了解真核生物RNA提取的原理；2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。

二、实验原理Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。

TRIzol的主要成分是苯酚。

苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。

苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。

用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。

1.材料甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯182. 试剂① 无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；② Trizol试剂；③ 氯仿；④ 异丙醇、75％乙醇；⑤ TBE缓冲液；⑥ 上样缓冲液（6×）3. 仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP管架四、实验方法1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min 使其自然分相；3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；6. 室温放置10 min晾干沉淀；7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。

1.RNA提取结果依照Trizol?试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。

2. RNA后电泳结果如图1. 其中9a为本组实验结果。

由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。

点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。

图1. RNA提取跑胶结果。

其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。

与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。

六、分析与讨论1. RNA的提取产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。

在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。

2. RNA电泳结果有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由tRNA， rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。

如果RNA没有降解，则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。

由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。

在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。

另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70℃保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。

在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。

七、总结：本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。

虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1. 2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。

那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。

首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。

其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。

最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。

实验二第1链cDNA的合成和模板的验证一、实验目的1.掌握第1链cDNA的合成方法和步骤二、实验原理真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。

以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。

真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。

引物：Oligo dT（12-18个T）。

莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV ）以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链（cDNA）。

mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR 比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

三、实验材料1. 材料徐薯18叶片RNA样品2. 试剂① dNTP mixture（10 mM each）；② Oligo (dT) Primer (10 μM)；③ Total RNA；④ RNase free ddH2O；⑤ M-MLV 反转录酶；⑥ 5×F irst-strand Buffer；⑦ M DTT；⑧ Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL)3. 仪器10μL 和100μL 的移液枪、的EP管、PCR仪等四、实验方法1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液：dNTP mixture（10 mM each） 1 μL*Oligo (dT) Primer (10 μM) 4 μLTotal RNA 2 μLRNase free ddHO up to 12 μL22.将混合物65 °C加热5 min，迅速在冰上冷却2 min，快速离心，然后加入下列成分：5×First-strand Buffer 4 μLM DTT 2 μLRibonuclease Inhibitor (40 U/μL) 1 μL3. 将混合物轻轻混匀，37℃温浴2 min；4. 加入M-MLV反转录酶（200U/μL）1 μL，用枪头轻轻吹打混匀；5. 37℃温浴50 min；6. 70 ℃加热15 min，使反转录酶失活，所得反转录产物可直接用于PCR反应。

附反转录模板的看家基因的验证（β-actin）引物以第一链cDNA为模板，β-actin-F和β-actin-R为引物，使用Taq酶进行PCR。

表1 β-actin PCR 反应体系（25μL体系）DNA模板1μL(约50 ng)10×PCR缓冲液(Mg2+ plus)μLMg2+μL10 mol/L TPS -F 1 μL10 mol/L TPS -R1μLmmol/L dNTPμLTaq 酶μL灭菌去离子水μL合计25 μL* PCR反应条件94℃ 2min95℃ 30sec62℃ 30sec68℃30sec最后，1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。

五、实验结果1.β-actin验证如图1. 其中编号1为Marker，3为本小组RNA样品β-actin验证结果。

由图可知，使用RNA模板通过RT-PCR得到了长度为198bp类似条带，但因产物浓度较低，该条带不甚清晰，并有部分弥散现象发生。

图1. β-actin验证电泳结果。

其中编号1为Marker，编号3为本小组RNA样品经RT-PCR 在加入引物IbActinF 、IbActinR后扩增出的β-actin产物。

六、分析与讨论1. RNA提取因实验一本小组RNA提取失败，故此实验采用老师准备的RNA进行验证。

2.β-actin验证结果如图1. 第3组为本小组验证结果。

其中β-actin能被cDNA模板扩增出，但条带模糊并有拖尾现象出现。

首先，因所得产物量较少，故电泳条带模糊，推测可能是在进行RT-PCR前，RNA有部分降解或于操作过程中损失部分所致。

其次，本实验在对β-actin产物进行电泳后结果出现拖带，可能原因主要有：1）30个循环cDNA第一链产物的含量过高；2）DNase降解DNA产生的寡核苷酸有非特异性扩增；3）PCR反应中引物过多；4）循环次数过多；5）退火温度过低；6）Taq酶过多；7）Mg2+浓度不合适。

综合本次试验分析，因实验条件已预先经过尝试，故导致拖带的最可能因素应为cDNA降解产生了寡核苷酸非特异性扩增片段。

由于照片清晰度欠佳，非特异性扩增片段无法清晰显示，但若与图2. 进行对比则可发现第2组β-actin验证图出现了非特异性扩增片段。

图2. 第2组β-actin验证图。

其中1为Marker，编号2、6可见清晰的两条带。

若要进行改进，则需尽量提取高质量RNA，防止其被DNA污染。

另外进一步优化PCR反应条件也是必不可少的环节，提高退火温度可防止非特异性起始与延伸。

七、总结本次实验虽只进行了模板验证，但让我们理解了RT-PCR的原理与其在真核生物基因克隆方面的运用。

整个过程中本小组成员较严格按照操作规范进行，所得β-actin产物验证也较成功。

今后实验需更加注意细节，不断完善自己的操作技巧，积累经验。

实验三甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因克隆一、实验目的1. 掌握PCR的方法和步骤。

二、实验原理聚合酶链反应(PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。