单克隆抗体制备技术的最新进展及应用作者姓名：程鹏王彤指导教师：王国卿单位名称：生物研究所专业名称：生物工程东北大学2013年6月单克隆抗体制备技术的最新进展及应用摘要单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作用, 在人类和动植物的免疫学诊断方面至今仍有着无可代替的重要作用。
本论文综述了单克隆抗体的制备技术，包括嵌合抗体、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、基因工程抗体等。
这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。
最后对单克隆抗体在临床医学和疾病的诊断与治疗等领域的广阔应用前景及存在的不足作了概述。
关键词：单克隆抗体；人源抗体；制备技术；应用目录单克隆抗体制备技术的最新进展及应用.......................................................................................... I I 摘要 ......................................................................................................................................... I I 第一章引言 .. (1)第二章单克隆抗体制备技术 (3)2.1嵌合单克隆抗体抗体 (3)2.2噬菌体展示技术 (3)2.3核糖体展示技术 (4)2.4RNA-多肽融合技术 (4)2.5转基因小鼠制备全人抗体 (5)第三章单克隆抗体的应用 (6)3.1单克隆抗体在预防方面应用 (6)3.2单克隆抗体在预防方面应用 (6)3.2.1 作为免疫抑制剂 (6)3.2.2 作为生物治疗的导向武器即所谓的“生物导弹” (7)3.3 单克隆抗体在蛋白提纯中的应用 (7)3.4 单克隆抗体在临床诊断及检测中的应用 (8)第四章结束语 (10)第五章展望 (11)注释 (12)参考文献 (13)第一章引言1975 年德国科学家 Kohler 和英国科学家 Mil－stein 利用杂交瘤技术将产生抗体的 B 淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术[1]，由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得 1984 年的诺贝尔医学和生理学奖，此后单克隆抗体迅速广泛地应用于生物学和医学的各个领域；1994年 Winter 等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步，该技术是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，使不经免疫既可获得任何一种动物（包括人）的特异性抗体成为可能，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系;生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体,可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原;其试剂可用于临床诊断和治疗,或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物等。
单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由 B 淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞。
把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体,另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力, 可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖, 从而分泌大量单克隆抗体。
但单克隆抗体技术自问世以来，在临床应用方面进展缓慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源单抗应用于人体治疗时存在诸多问题：鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fc受体相关的效应系统；被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody, HAMA)反应[2]；且在人体循环系统中很快被清除。
因此，在保持对特异抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化和全人化的改造，减少异源抗体的免疫原性成为单抗研究的重点。
此外，传统杂交瘤技术还存在制备周期较长，成本较高，杂交瘤细胞不稳定和抗性会丢失等缺陷。
近年来，随着分子生物学技术的发展，出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所制备的单克隆抗体。
这些技术可有效解决传统杂交瘤技术所存在的问题，为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间。
第二章单克隆抗体制备技术2.1 嵌合单克隆抗体抗体嵌合单克隆抗体产生于1980年代中期，是应用DNA重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组，再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。
根据所用的载体质粒标记基因产物，选用适当的抗生素或试剂进行筛选，再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。
但这种抗体仍保留了原来鼠源抗体约 30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAMA)。
为了进一步提高嵌合抗体的人源化，在嵌合抗体的制备过程中又引进了重构抗体技术和表面重塑技术[3-4]以提高抗体的人源化。
1980年代中后期，科学家对嵌合抗体进一步改进后，抗体基因只有互补性决定区(complementarity determining reign, CDRs)[5]是鼠源成分，其余均为人基因序列，这实现了抗体的高度人源化。
嵌合抗体不但具有与鼠源单抗相同的特异性、亲和力和产量，而且可根据不同的需要接上不同亚类的人恒定区基因来改变抗体的功能,使用更加灵活。
第一个人源化单抗rituxan是一个抗CD20的人鼠嵌合型单抗，在非何杰氏恶性淋巴瘤患者的治疗中取得了良好的疗效。
目前，嵌合单克隆抗体基本主宰着治疗性单抗的商品市场，截止到2003年初，共有9个单克隆抗体被美国FDA 授予生物药许可证,都是人鼠嵌合抗体或人源化的抗体类型。
虽然CDR仅占整个嵌合抗体分子的5%以下，但仍有鼠源成分的存在，并未完全解决鼠抗体的免疫原性问题，而且人源化过程繁复且费用昂贵，大量的反复试验不可避免。
2.2 噬菌体展示技术噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。
这项技术的基本原理是：用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬菌体抗体文库。
这样在噬菌体表面表达特定抗体片段，而在噬菌体核心DNA中则含有该抗体片段的基因。
噬菌体库包括多种抗体可变区的基因序列，一些噬菌体抗体文库已经含有达到1011种不同的噬菌体抗体。
抗体的具体制备方法是将抗原包被在固项介质上,加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合,获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。
用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌，使该噬菌体颗粒得到扩增。
将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。
噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建立后,就可以根据需要直接从文库中筛选得到针对目标抗原的特异性抗体，通常只需要23周的时间，大大缩短了单克隆抗体的制备周期。
当抗体分离出来时，噬菌体系统同时也提供了设计抗体亲和性及其应用的模式。
但是该技术也存在一定的缺陷，由于受表达系统的限制，抗体库的库容不足以支持获得稀有的抗体，而且对噬菌体或表达宿主的生长或功能产生抑制作用的抗体也难以获得。
2.3 核糖体展示技术核糖体展示技术是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的新技术。
转基因小鼠和噬菌体展示技术均依赖于细胞技术和体内基因的表达，所建库的容量和分子多样性片段的连接处,嘌呤霉素就会进入核糖体的酰氨化位点,并在肽酰转移酶的作用下与多肽之间形成稳定的酰胺键。
所得到的多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物与核糖体分离后可直接进行筛选。
多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物较mRNA -核糖体-蛋白复合物更为稳定,实验证明mRNA -核糖体-蛋白复合物可以在4e条件下完整保存10天左右,并允许剧烈的亲和筛选,足以筛选到高亲和性的抗体。
由于该技术采用共价偶联的方法,因此也被称为共价展示技术。
2.4 RNA-多肽融合技术RNA-多肽融合技术也被称为 mRNA 展示技术或体外病毒技术。
利用核糖体展示技术在筛选过程中,由于核糖体是相对分子量为2 000 000的大分子,而一个典型的肽库或抗体库中可供选择的分子大小一般都小于100 000。
这样在核糖体大分子和被展示的小分子之间由于空间位阻可能会产生一些不可预知的变化,导致目标分子的丢失。
由Phylos公司开发的RNA-多肽融合技术基本克服了这一缺点。
RNA-多肽融合技术是将mRNA的3’末端和抗体蛋白质的羧基端借助嘌呤霉素分子共价连接在一起。
具体方法是抗体库中的DNA转录出RNA后,在mRNA的3’端共价连接一个嘌呤霉素标记的DNA片段,作为合成的衔接物。
在体外无细胞翻译系统中转录时,核糖体在mRNA分子上移动合成多肽。
当到达mRNA分子末端时,核糖体停止在mRNA与DNA片段的连接处,嘌呤霉素就会进入核糖体的酰氨化位点,并在肽酰转移酶的作用下与多肽之间形成稳定的酰胺键。
所得到的多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物与核糖体分离后可直接进行筛选。
多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物较mRNA -核糖体-蛋白复合物更为稳定,实验证明mRNA -核糖体-蛋白复合物可以在4e条件下完整保存10天左右,并允许剧烈的亲和筛选,足以筛选到高亲和性的抗体。
由于该技术采用共价偶联的方法,因此也被称为共价展示技术。
2.5 转基因小鼠制备全人抗体转基因小鼠的 Ig 基因是用人的相应基因替代，产生对人免疫系统非异种抗体，这种影响人抗体的策略是改造小鼠的体液免疫系统，将人 Ig 基因微位点转入小鼠，产生能分泌人 Ig 的转基因小鼠。
这样可省去对抗体分子重构时在基因水平的复杂性，保留了完整的 Ig 类别转换和亲和力成熟的自然机理。
这种转基因小鼠的不足之处在于基因片段较小，仅 30 kb 左右，因此这种抗体在面对抗原多样性时，其抗体应答显得单薄而不足[6]。
此后，Green 等[7]人利用基因打靶技术将编码人抗体轻重链的基因片段大约 18 Mb 的 DNA 全部转到自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中，再经过繁育筛选，建立了稳定的转基因小鼠品系。
这样得到的转基因小鼠对特异的抗原能产生高亲和力的人源抗体。
再用传统的杂交瘤技术，将表达特异抗体的转基因小鼠 B 细胞和骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生人源抗体。
第三章单克隆抗体的应用单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。
这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学、医学、农业、食品、环境等众多领域，其在基础研究、蛋白纯化、环境与食品监测、疾病诊断、预防及治疗和优生优育等方面均有不可替代的作用。