三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较赵自云牟晓峰江秀爱(山东省青岛市中心医院，青岛266042)【摘要l目的比较苯唑西林纸片扩散法、微量琼脂稀释法(M I C)和聚合酶链反应(t K I R)法检测甲氧西林耐药金黄色葡萄球茵(M磁滤)的差异。
方法用上述3种方法同时检测86株临床分离的金黄色葡萄球茼。
结果3种方法同时辁测出53株M R SA和33株甲氧西林敏感金黄色葡萄球茵，一致性为100％。
结论三种方法都适于临床实验室准确检测M R SA，尤其是纸片扩散法和M I C法可作为不同级别临床常规实验室确证M R SA检测方法。
【关键词】金黄色葡萄球茵；甲氧西林；苯唑西林纸片扩散法；微量琼脂稀释法；聚合酶链反应C om par e t hr ee m e t hods t o de t ect l V l R SA Z b．a o zi yun，M u X m of ezl g，扭l ng xi t塘i(Q iD gc ho cen t r al h盎pi t al，Q m gdao，266042)【A b st m et】O bj ec啦ve T o co m p ar e t he di f fer ences of t he ox aci ll i n dis k dif fus ion m e t hod，m i cr o—agar di l ut i on(m c)and r m l ym er ase chai n r ea ct i on(P CR)t o det ect i on t he m ethi ei l li n—res i s t ant St aphyr l ococcm aul-el l8(M R SA)。
M e t hods t hr ee m e t h ods w eFe per f or m ed t o1y ze86c l i ni cal i sol a t es of St aphyl o coccus al al℃1．t S．Ih爆咄s53M R SAa nd33m et hi ci U i n—s ens i t i veSt aphyl ococcusaun吣w e陀det ect ed by t het hr ee m et hod s，s peci fi ci t y w a d00％，s em d t i v i t y w as l oo％。
C ondus i on T h esem ethods勰s ui tabl e f or c li nic al l abor ator ies t o a ee tt r at el y det ect M RSA．es peci al l y t he dis k dif f usi on m et hod a nd M I C coul d be us ed f or di ff e rent l eve ls0【f m u l i n e c l i ni cal l ab or at o r y con f i r m ed M1t SAdet ec t ion．【K ey words]St aphyl赫'ns aureus；M et hiei l li n；T he ox aci ll i n di sk dif fus ion4m et h od；M i er e—agar di l u t i on；P ol ym eras e chai n r eact ion金葡菌是临床最常见的病原菌之一，在临床分离菌中分离率位居前列，其中以m et hi ei l l i n—r esi st ant St a phyl ococc us aur eus(M R SA)临床意义尤为重要。
由于其多重耐药性和易造成医院感染的暴发流行，已成为临床抗感染治疗的一大难题Ll。
2J。
M R SA对抗生素的耐药性日趋严重且对多种抗生素耐药，因此M R SA引起的医院感染一旦发生，常难以控制。
为了解我院医院感染的M R SA耐药表型与基因型之间的关系，进一步加强对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速、及时检出，有效控制M R S A造成的感染，指导临床用药，限制其传播，本文对我院目前常用的检测方法进行了比较。
I材料与方法1．1菌株来源黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)、金黄色葡萄球菌A T C C43300、大肠埃希菌标准株(A T C C25922)为本室保存；m ecA基因阳性标准M R SA菌株(SA0129)由美国Pf i zer公司研究所提供。
临床标本由青岛大学医学院第二附属医院检验科提供，共86株，包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(M SSA)和株M R S A。
标本主要来源于创面分离物、引流液、痰、血、中段尿等送检标本。
1．2试剂和仪器基因组D N A提取试剂盒购自美国Pr om ega公司；PC R试剂(Taq D N A聚合酶、4X dN TPs、10×buff er等)购自加拿大M B I公司；D N A M ar ker购自大连T akar a公司；利用D N A S t ar软件设计的引物由上海生工公司合成。
苯唑西林为英国O xoi d公司产品。
4800型D N A扩增仪为美国PE R K IN公司产品；M i cr os can半自动细菌鉴定仪为美国D at e B蛐公司生产。
1．2实验方法1．2．1纸片扩散法1．2．1．1将待测细菌用0．45％N aC I溶液制成0．5麦氏单位(1．5×10C FU／m1)的菌悬液。
用接种环将茵悬液划种在和M ul l er—H i nt on平板，然后贴苯唑西林纸片，将种好的平板放入37℃培养箱孵育24小时。
金黄色葡萄球菌A TC C25923作为苯唑西林阴性质控菌株、金黄色葡萄球菌A TC C43300作为苯唑西林阳性质控菌株。
1．2．1．2结果判断标准：苯唑西林纸片扩散试验抑菌圈直径≤11m m为耐药；抑菌圈≥12r am为敏感。
1．2．2微量琼脂稀释法：用M i er os ea n细菌鉴定仪测定苯唑西林M I C，判断标准遵循临床实验室标准一化委员会(C Ls I)制定的法规：M I C>4u∥I nl为M R．SA。
1．2．3聚合酶链反应法检测m ec A基因：1．2．3．1引物的设计在G eneB ank中收集m eeA基因的序列，用P r i m er Pr i m i e z5．0软件设计m e cA、基因扩增引物。
耐甲氧西林葡萄球菌m ecA基因的引物如下P1：5—1A G-I-r C TA G T I G T C G G G T一3，P2：5一TA TC G G A C G Tr cA G TC A T一3，扩增产物为165bp片断；1．2．3．2细菌D N A的提取按美国P r om ega公司生产的基因组D N A提取试剂盒(W i za r d G enom i c D N A Pur i f i cat i on K i t)操作说明书操作。
1．2．3．3目的基因的PC R扩增，取上述提取的M SS A、M R SA及大肠埃希氏菌标准株(A TC C25922)对照菌株的D N A各1肛l作为扩增的模板，加入PC R反应体系，引物、M gC L2、dN T P终浓度分别为2弘M、250pt M、250nM，1×PCR buf f er，0．6u以L T aq酶，反应总体积25出。
PC R反应参数94c|C预变性6m i n，(94℃60s，500C30s，72℃45s)×35个循环，72℃延伸10rai n。
1．2．3．4扩增完毕后每管各取3／dPC R产物，D N A M ar ker2．5t d，经1．2％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察结果。
2结果2．1纸片扩散法法结果苯唑西林抑菌圈直径≥12m m的敏感菌33株，抑菌圈<1l m m的耐药菌株53株。
2．2微量琼脂稀释法法结果苯唑西林M I C≤4ug／m l的敏感菌33株，苯唑西林M I C>4ug／r nl的耐药菌53株。
2．3PC R法检测m ecA未出现165bpm e cA条带的敏感菌33株，出现165bpm ecA条带的耐药菌56株。
2．4三种检测方法结果比较3种方法检测金黄色葡萄球菌的结果敏感株333333耐药株535353三种方法经x!检验X2=0．P=1．检测结果差异无显著性。
以m ecA基因检测呈阳性为“金标准”，共检出53株M R SA，阳性率为61．6％。
苯唑西林纸片扩散法法敏感性100％，特异性100％；苯唑西林微量稀释法敏感性100％，特异性100％。
图1m ee A基因PE R扩增扩增产韧琼脂糖凝胶电泳结果l为黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)．2为大肠埃希菌标准株(A TC C25922)．3为·m ec A基因阳性标准M R SA菌株(S A0129)．4为标本M R S A．M为M ar ker3讨论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)是医院感染的重要病原菌之一，自1961年在英国首次被报道以来，其感染率不断上升，目前医院正面临着M I L SA 感染日益严重和多重耐药的挑战。
M R SA对包括甲氧西林在内的多种抗菌药物耐药，由它所致的感染易呈流行或暴发流行，治疗困难且病死率高，成为临床治疗的一大难题。
因此，快速、尤其是准确的的检测M R S A已成为各医院临床微生物室的重要任务。
M R S A检测方法常采用的有临床实验室标准化委员会(C L SI)推荐的苯唑西林纸片扩散法和头孢西丁纸片扩散法，还有应用自动细菌鉴定仪测定最低抑菌浓度(M IC)筛选方法，以及分子生物学方法检测m ecA基因等方法。
本文利用苯唑西林纸片扩散法，最低抑菌浓度(M I C)筛选方法，以及检测m ecA 基因三种方法同时进行检测，对各方法之间结果进行比较，以便不同医院根据自己的实际情况选择合适的方法进行M R SA的筛选。
m eeD N A是耐甲氧西林葡萄球菌特有的D N A序列，长约30．45kb，位于细菌染色体上，通常在pur—nov—hi s基因族附近，m ee基因由m ea A、m ec I、m ec m 及20—40kb的m ec相关D N A组成。
m ecA为结构基因，主要编码PB P2a蛋白，决定菌株是否对甲氧西林耐药。
现已经明确，由m eeA基因编码的PB P2a是葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要原因，因此m ecA 基因被作为耐甲氧西林葡萄球菌(m et hi ei l l i n r es i s t an t s t aphyl ococci，M R s)的分子标志，(下转34页)胞之间的窦周间隙，胞浆内含有脂滴为其特征，可贮存，脂肪与维生素A，能产生多种胶原与非胶原基质成分，在肝纤维化过程中，贮脂细胞在多种因子作用下增生活化，并转化为肌纤维母细胞及合成纤维细胞，产生大量胶原及基质，对肝纤维化的发生具有重要作用E9]。